Spytt- og fekalmikrobiomet til pasienter med tilbakevendende aftøs stomatitt før og etter behandling med probiotika

Hensikten med studien Hensikten med denne studien er å karakterisere spytt- og avføringsmikrobiomet hos pasienter med residiverende aftøs stomatitt (RAS) og å sammenligne funnene med funnene til en matchet frisk kontrollgruppe. Et annet formål er å undersøke effekten av behandling med probiotika på mikrobiomet i hel spytt og avføring samt alvorlighetsgrad og antall RAS-utbrudd. Dessuten vil det bli tatt et utstryk fra tilstedeværende aftøse sår før og etter behandling med probiotika for å karakterisere den lokale mikrobiotaen.

Det antas at mikrobiomet i hel spytt og avføring fra pasienter med RAS (minor eller major type afthous ulcers) skiller seg fra mikrobiomet i hel spytt og feces fra alders- og kjønnsmatchede kontrollpersoner.

Det antas også at probiotisk behandling har en gunstig effekt på slimhinnesmertene og reduserer alvorlighetsgraden av RAS og hyppigheten av utbrudd. Videre er det antatt at behandling med probiotika har effekt på mikrobiom i hel spytt og avføring fra pasienter med RAS.

Bakgrunn Residiverende aftøs stomatitt (RAS) er en av de vanligste ulcerøse sykdommene som påvirker munnslimhinnen. Prevalensen varierer fra 5-25 %. Etiologien er fortsatt ukjent, men flere lokale, systemiske, immunologiske, genetiske, allergiske, ernæringsmessige og mikrobielle faktorer har blitt foreslått som forårsakende midler.

Klinisk er RAS karakterisert ved tilbakevendende anfall av ett eller flere avrundede, grunne, smertefulle munnsår med intervaller på noen måneder eller dager.

RAS kan klassifiseres i tre forskjellige typer: mindre, større og herpetiform. Mindre RAS utgjør ca. 80 % av tilfellene. Denne typen er preget av aftøse sår med en diameter på ca. 5 mm, ofte lokalisert i bukkal- og labialslimhinnen. Sårene gror i løpet av 7-10 dager uten at det dannes arr. Major RAS vises hos 10-15% av pasientene. Sårene er ofte krateriforme med en diameter på 10-30 mm, og finnes typisk på labialslimhinnen, den myke ganen, tonsillarregionen og orofarynx. Helingstiden kan variere fra 2 til 6 uker og forlate cicatrix. Disse sårene er svært smertefulle og matinntaket kan være kompromittert. Prevalensen av den herpetiforme typen er 5-10%.

Denne typen er ofte lokalisert i munnbunnen og den ventrale delen av tungen, og den er preget av aggregering av flere små sår.

Etiologien er fortsatt ukjent, men en rekke lokale og systemiske faktorer antas øke predisposisjonen, inkludert slimhinnetraumer, stressende hendelser, hormonelle endringer, røykeslutt, allergi mot ulike matstoffer samt vitamin- og/eller mineralmangel. Det er også en genetisk disposisjon da muligheten for å utvikle RAS er 90 % hvis begge foreldrene har RAS og 20 % hvis en av foreldrene har RAS.

Mikrobielle faktorer En rekke mikroorganismer har blitt foreslått involvert i etiopatogenesen av RAS. Disse inkluderer orale streptokokker, spesielt Streptococcus mitis, men kryssreaksjonen mellom orale streptokokker og orale slimhinneantigener er uspesifikk og anses som klinisk ubetydelig. Helicobacter pylori, som er assosiert med gastritt og duodenalsår kan også sees i tannplakk og derfor også antydes involvert i patogenesen av RAS, men anti-H. pylori seropositivitet er ikke funnet økt hos pasienter med RAS. Ulike vira er funnet i biopsier fra aftøse sår som cytomegalovirus og Epstein-Barr-virus. Herpes simplex, varicella zoster og adenovirus har også blitt antatt å spille en rolle i etiopatogenesen. Det har imidlertid ikke vært mulig å vise en årsakssammenheng mellom virusinfeksjon og RAS, og virus-DNA kan være tilstede på grunn av en sekundær infeksjon.

Nye teknologier forbedrer vår evne til å gjøre mer dyptgående analyser av mikrobiotaen hos pasienter med RAS. Under arbeidet med denne studieprotokollen er det publisert en studie på mikrobiomet hos pasienter med RAS som viser en økt andel Bacteroides-arter i munnslimhinnen til pasienter med RAS sammenlignet med friske kontroller. Som tidligere studier også antyder, ser den orale mikrobiota ut til å spille en rolle i utviklingen av RAS så vel som i videreføring av RAS.

I denne studien vil vi karakterisere mikrobiomet i hel spytt, feces og aftøse sår hos pasienter med RAS (med aktive lesjoner) og analysere hvordan det skiller seg fra mikrobiomet til friske forsøkspersoner. Denne karakteriseringen kan være avgjørende for vår forståelse av patogenesen av RAS og bidra til utviklingen av nye strategier for å håndtere disse pasientene.

Immunopatologiske faktorer Flere studier indikerer at patogenesen av RAS inkluderer en rekke cellemedierte mekanismer, men den eksakte immunopatogenesen er fortsatt ikke avklart. Fagocytiske og cytotoksiske T-lymfocytter kan være en rolle i ødeleggelsen av det orale epitelet og tilstedeværelsen av disse immuncellene reguleres og opprettholdes av lokal frigjøring av cytokiner. Pasienter med utbrudd av RAS har økt tilstedeværelse av gamma-delta T-celler i blodet sammenlignet med friske kontrollpersoner og pasienter uten aktiv RAS. Dessuten har pasienter med RAS en økt tilstedeværelse av Tumor Necrosis Factor (TNF)-alfa sammenlignet med de som ikke har RAS, men også andre proinflammatoriske cytokiner som interleukin-2 og -6 vil sannsynligvis spille en rolle i patogenesen av RAS . Til slutt er det funnet aftøslignende sår assosiert med en rekke inflammatoriske tarmsykdommer som ulcerøs kolitt og Crohns sykdom og cøliaki samt syklisk nøytropeni, HIV-infeksjon og immunglobulin A (IgA)-mangel. Følgelig kan en immunkomponent være involvert i RAS som bidrar til en endring i tarmmikrobiotaen eller omvendt. I denne studien vil vi karakterisere mikrobiotaen i spytt og i feces fra pasienter med RAS før, under og etter behandling med probiotika.

Studiedesign og metoder Prosjektet omfatter en tverrsnittsstudie som undersøker mikrobiomet i hel spytt og feces fra 20 pasienter med RAS og 20 friske kontrollpersoner. Prosjektet inkluderer også en dobbeltblind randomisert placebokontrollert intervensjon med probiotika (Lactobacillus reuteri-holdige sugetabletter 2 tabletter daglig i 3 måneder) eller placebo. Spytt- og avføringsmikrobiomet hos RAS-pasienter sammenlignes før og etter behandling.

Pasientene med RAS rekrutteres blant pasienter henvist til Oral Medicine Clinic, Det helse- og medisinske fakultet, Københavns Universitet. De 20 friske kontrollene rekrutteres via www.forsoegsperson.dk

Metoder inkluderer:

• Intervju vedr. utbrudd av RAS, orale symptomer (vurdert ved hjelp av en visuell analog skala), komorbiditet, medisininntak, røyke- og alkoholvaner, munnhygienevaner.
• Samling av tyggeparafinstimulert hel spytt.
• Muntlig undersøkelse inkludert vurdering av aftøse sår (Ulcer Severity Score), registrering av tannstatus og periodontal status.
• Et utstryk fra et av de aftøse sårene.
• En avføringsprøve vil bli tatt av forsøkspersonene selv i deres hjem etter grundig instruksjon og håndtert i henhold til manual fra Statens Serum Institut. Fra prøven samles 250 mg og holdes i en fryser holdt ved -80°C inntil videre bearbeiding og analyse.
• En blodprøve som inkluderer hemoglobin (HgB), C-reaktivt protein (CRP), jern, kobalamin, folat, transferrin, ferritin og vitamin D-nivåer.

Ekstraksjon av bakteriell DNA fra spytt-, avførings- og utstryksprøver (ved baseline, 7-dagers og 90-dagers intervensjon med henholdsvis probiotika eller placebo) vil bli utført i laboratoriet ved Odontologisk Institutt, Københavns Universitet, ved bruk av tidligere etablerte prosedyrer basert på instruksjoner fra Human Microbiome Project.

Metagenomiske analyser på ekstrahert bakteriell DNA fra spytt, utstryk og avføringsprøver er laget av Beijing Genomics Institute. Illumina 16S rDNA-sekvensering tillater bestemmelse av bakteriell taksonomi og fylogenetisk mangfold.