Das Speichel- und Fäkalmikrobiom von Patienten mit rezidivierender aphthöser Stomatitis vor und nach der Behandlung mit Probiotika

Ziel der Studie Ziel dieser Studie ist es, das Speichel- und Stuhlmikrobiom bei Patienten mit rezidivierender aphthöser Stomatitis (RAS) zu charakterisieren und die Ergebnisse mit denen einer gematchten gesunden Kontrollgruppe zu vergleichen. Ein weiteres Ziel ist es, die Wirkung der Behandlung mit Probiotika auf das Mikrobiom im gesamten Speichel und Kot sowie die Schwere und Anzahl von RAS-Ausbrüchen zu untersuchen. Außerdem wird von bestehenden Aphthen vor und nach der Behandlung mit Probiotika ein Abstrich genommen, um die lokale Mikrobiota zu charakterisieren.

Es wird angenommen, dass sich das Mikrobiom im gesamten Speichel und Kot von Patienten mit RAS (Aphthen vom Typ Minor oder Major) von dem Mikrobiom im gesamten Speichel und Kot von alters- und geschlechtsangepassten Kontrollpersonen unterscheidet.

Es wird auch die Hypothese aufgestellt, dass die probiotische Behandlung eine positive Wirkung auf die Schleimhautschmerzen hat und die Schwere von RAS und die Häufigkeit von Ausbrüchen reduziert. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Behandlung mit Probiotika eine Wirkung auf das Mikrobiom im gesamten Speichel und Kot von Patienten mit RAS hat.

Hintergrund Die rezidivierende aphthöse Stomatitis (RAS) ist eine der häufigsten ulzerativen Erkrankungen der Mundschleimhaut. Die Prävalenz variiert zwischen 5-25%. Die Ätiologie bleibt unbekannt, aber mehrere lokale, systemische, immunologische, genetische, allergische, ernährungsbedingte und mikrobielle Faktoren wurden als ursächliche Mittel vorgeschlagen.

Klinisch ist RAS durch wiederkehrende Anfälle von einem oder mehreren abgerundeten, flachen, schmerzhaften Mundgeschwüren in Abständen von einigen Monaten oder Tagen gekennzeichnet.

RAS kann in drei verschiedene Typen eingeteilt werden: kleinere, größere und herpetiforme. Kleinere RAS machen etwa 80 % der Fälle aus. Dieser Typ ist durch aphthöse Geschwüre mit einem Durchmesser von etwa 5 mm gekennzeichnet, die häufig in der Wangen- und Lippenschleimhaut lokalisiert sind. Die Geschwüre heilen innerhalb von 7-10 Tagen ohne Narbenbildung ab. Größere RAS treten bei 10-15 % der Patienten auf. Die Geschwüre sind oft kraterförmig mit einem Durchmesser von 10-30 mm und treten typischerweise an der Lippenschleimhaut, dem weichen Gaumen, der Mandelregion und dem Oropharynx auf. Die Heilungszeit kann zwischen 2 und 6 Wochen variieren und Narben hinterlassen. Diese Geschwüre sind sehr schmerzhaft und die Nahrungsaufnahme kann beeinträchtigt sein. Die Prävalenz des herpetiformen Typs beträgt 5-10%.

Dieser Typ ist oft im Mundboden und im ventralen Teil der Zunge lokalisiert und durch die Anhäufung mehrerer kleiner Geschwüre gekennzeichnet.

Die Ätiologie ist noch unbekannt, aber es wird angenommen, dass eine Reihe lokaler und systemischer Faktoren die Prädisposition erhöhen, darunter Schleimhauttrauma, Stressereignisse, hormonelle Veränderungen, Raucherentwöhnung, Allergie gegen verschiedene Nahrungsmittel sowie Vitamin- und/oder Mineralstoffmangel. Dies ist auch eine genetische Veranlagung, da die Möglichkeit, RAS zu entwickeln, 90 % beträgt, wenn beide Elternteile RAS haben, und 20 %, wenn einer der Elternteile RAS hat.

Mikrobielle Faktoren Es wurde vorgeschlagen, dass eine Reihe von Mikroorganismen an der Ätiopathogenese von RAS beteiligt sind. Dazu gehören orale Streptokokken, insbesondere Streptococcus mitis, aber die Kreuzreaktion zwischen oralen Streptokokken und oralen Schleimhautantigenen ist unspezifisch und wird als klinisch unbedeutend angesehen. Helicobacter pylori, der mit Gastritis und Zwölffingerdarmgeschwüren in Verbindung gebracht wird, kann auch in Zahnplaque gesehen werden und daher ebenfalls an der Pathogenese von RAS beteiligt sein, aber der Anti-H. pylori-Seropositivität wurde bei Patienten mit RAS nicht erhöht gefunden. In Biopsien von Aphthen wurden verschiedene Viren wie Cytomegalovirus und Epstein-Barr-Virus gefunden. Auch Herpes simplex, Varicella zoster und Adenovirus werden in der Ätiopathogenese vermutet. Es war jedoch nicht möglich, einen kausalen Zusammenhang zwischen einer Virusinfektion und RAS aufzuzeigen, und virale DNA kann aufgrund einer Sekundärinfektion vorhanden sein.

Neuartige Technologien verbessern unsere Fähigkeit, eingehendere Analysen der Mikrobiota bei Patienten mit RAS durchzuführen. Während der Arbeit an diesem Studienprotokoll wurde eine Studie zum Mikrobiom bei Patienten mit RAS veröffentlicht, die einen erhöhten Anteil von Bacteroides-Spezies in der Mundschleimhaut von Patienten mit RAS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen zeigt. Wie frühere Studien ebenfalls andeuten, scheint die orale Mikrobiota eine Rolle bei der Entwicklung von RAS sowie bei der Aufrechterhaltung von RAS zu spielen.

In dieser Studie werden wir das Mikrobiom im gesamten Speichel, Kot und den Aphthen von Patienten mit RAS (mit aktiven Läsionen) charakterisieren und analysieren, wie es sich vom Mikrobiom gesunder Probanden unterscheidet. Diese Charakterisierung könnte wesentlich für unser Verständnis der Pathogenese von RAS sein und zur Entwicklung neuartiger Strategien zur Behandlung dieser Patienten beitragen.

Immunpathologische Faktoren Mehrere Studien deuten darauf hin, dass die Pathogenese von RAS eine Reihe von zellvermittelten Mechanismen umfasst, aber die genaue Immunpathogenese ist noch nicht geklärt. Phagozytische und zytotoxische T-Lymphozyten können bei der Zerstörung des oralen Epithels eine Rolle spielen, und das Vorhandensein dieser Immunzellen wird durch die lokale Freisetzung von Zytokinen reguliert und aufrechterhalten. Patienten mit RAS-Ausbruch haben im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und Patienten ohne aktives RAS eine erhöhte Präsenz von Gamma-Delta-T-Zellen im Blut. Darüber hinaus weisen Patienten mit RAS im Vergleich zu Patienten ohne RAS eine erhöhte Präsenz von Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha auf, aber auch andere proinflammatorische Zytokine wie Interleukin-2 und -6 spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Pathogenese von RAS . Schließlich wurden aphthöse Geschwüre im Zusammenhang mit einer Reihe von entzündlichen Darmerkrankungen wie Colitis ulcerosa und Morbus Crohn und Zöliakie sowie zyklischer Neutropenie, HIV-Infektion und Immunglobulin A (IgA)-Mangel gefunden. Dementsprechend kann an RAS eine Immunkomponente beteiligt sein, die zu einer Veränderung der Darmmikrobiota beiträgt oder umgekehrt. In dieser Studie werden wir die Mikrobiota im Speichel und im Stuhl von Patienten mit RAS vor, während und nach der Behandlung mit Probiotika charakterisieren.

Studiendesign und Methoden Das Projekt umfasst eine Querschnittsstudie, die das Mikrobiom im gesamten Speichel und Kot von 20 Patienten mit RAS und 20 gesunden Kontrollpersonen untersucht. Das Projekt umfasst auch eine doppelblinde randomisierte Placebo-kontrollierte Intervention mit Probiotika (Lactobacillus reuteri-haltige Lutschtabletten 2 Tabletten täglich für 3 Monate) oder Placebo. Das Speichel- und Stuhlmikrobiom von RAS-Patienten wird vor und nach der Behandlung verglichen.

Die Patienten mit RAS werden unter Patienten rekrutiert, die an die Oral Medicine Clinic, Fakultät für Gesundheits- und Medizinwissenschaften, Universität Kopenhagen, überwiesen werden. Die 20 gesunden Kontrollpersonen werden über www.forsoegsperson.dk rekrutiert

Zu den Methoden gehören:

• Interview bzgl. Beginn des RAS, orale Symptome (ermittelt mittels einer visuellen Analogskala), Komorbidität, Medikamenteneinnahme, Rauch- und Alkoholgewohnheiten, Mundhygienegewohnheiten.
• Sammlung von kaubarem Paraffin-stimuliertem Vollspeichel.
• Mündliche Untersuchung inkl. Auswertung der Aphthen (Ulcer Severity Score), Erfassung des Zahnstatus und Parodontalstatus.
• Ein Abstrich von einem der aphthösen Geschwüre.
• Eine Kotprobe wird von den Probanden nach gründlicher Einweisung zu Hause selbst entnommen und gemäß der Anleitung des Statens Serum Institut behandelt. Von der Probe werden 250 mg gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung und Analyse in einem bei –80°C gehaltenen Gefrierschrank aufbewahrt.
• Ein Bluttest einschließlich Hämoglobin (HgB), C-reaktives Protein (CRP), Eisen, Cobalamin, Folat, Transferrin, Ferritin und Vitamin D-Spiegel.

Die Extraktion bakterieller DNA aus Speichel-, Kot- und Abstrichproben (zu Studienbeginn, 7-tägiger und 90-tägiger Intervention mit Probiotika bzw. Placebo) wird im Labor der Abteilung für Odontologie der Universität Kopenhagen unter Verwendung zuvor etablierter Methoden durchgeführt Verfahren basierend auf Anweisungen des Human Microbiome Project.

Metagenomische Analysen an extrahierter bakterieller DNA aus Speichel-, Abstrich- und Kotproben werden vom Beijing Genomics Institute durchgeführt. Die Illumina 16S rDNA-Sequenzierung ermöglicht die Bestimmung der bakteriellen Taxonomie und phylogenetischen Diversität.