Kann COVID-19 in der Augenflüssigkeit verbleiben?

Tierstudien und frühere Humanstudien

Andere Maus- und Katzenmodelle des Coronavirus zeigten eine Augenbeteiligung. Im Experiment von Robbins et al. erhielten Mäuse intrakamerale und intravitreale Injektionen mit murinem Coronavirus. Innerhalb von 3 Tagen zeigten diejenigen, denen Injektionen in den AC verabreicht wurden, verschiedene Befunde wie Keratitis und Uveitis anterior; wohingegen diejenigen, die sich einer intravitrealen Injektion unterzogen hatten, mehrschichtige Netzhautläsionen mit RPE-Narbenbildung und Netzhautatrophie aufwiesen. Bei einem Drittel der Patienten, die intravitreale Injektionen erhielten, kam es zu ZNS-Erkrankungen und/oder zum Tod. Aus diesen Mäusen wurden virale Antigene isoliert, es gibt jedoch Hinweise darauf, dass auch Immunzellen und entzündungsfördernde Faktoren zu den Retinopathie-Befunden beitragen. Dieses Mausmodell, bekannt als Experimentelle CoV-Retinopathie, wurde verwendet, um die Immunantwort des Wirts zu untersuchen, die zu Netzhautschäden führt. Katzen, die mit dem felinen infektiösen Peritonitisvirus, einem felinen Coronavirus, infiziert waren, äußerten sich in Konjunktivitis, pyogranulomatöser Uveitis anterior, Netzhautvaskulitis, Aderhautentzündung und Netzhautablösung. Bei über 90 % der Katzen wurde ein Antigen in der Bindehaut nachgewiesen.

Viren wie VZV, HSV und CMV sowie Parasiten wie Toxoplasmose wurden trotz normaler oder negativer Serumtiter mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) aus der Augenflüssigkeit menschlicher Augen isoliert.

Einschreibung/Randomisierung

Diejenigen, die die Einschlusskriterien erfüllen, erhalten die Möglichkeit, an der Studie teilzunehmen. Sie werden eine schriftliche Einverständniserklärung gemäß den HIPAA-Vorschriften und der Vanderbilt IRB-Genehmigung abgeben.

Studienabläufe

• Für die Studie ausgewählte Patienten:

  Insgesamt 80 Patienten

  20 Patienten, die sich einer Augenoperation unterziehen und COVID-negativ sind, werden als Kontrollpatienten einbezogen und den gleichen Verfahren unterzogen. 60 Patienten, die sich einer Augenoperation mit einer früheren COVID-Infektion unterziehen, werden nach der Zeit seit der Diagnose in drei Gruppen eingeteilt: 3, 6, 12 Monate ~ 20 Patienten pro Gruppe.

  • Alle Patienten erhalten einen Glaskörperhahn vom operierten Auge 0,1–0,2 ml Flüssigkeit. Diese frische Probe wird mit einem eindeutig gekennzeichneten Etikett an das Labor geschickt. Dies wird durchgeführt, nachdem der Trokar platziert wurde
  • Am Ende der Operation wird der BSS-Beutel mit demselben Etikett per Schlauch ins Labor geschickt.
• Die Einverständniserklärung wird während des präoperativen Klinikbesuchs eingeholt
• Die Proben erhalten ein spezielles farbiges Etikett und werden vom OP an das Labor von Dr. Schmitz und Dr. Maris geschickt

Laboranalysen

VUMC MIDL Labortestprotokoll:

• Proben: 100–200 µl trockene Glaskörperflüssigkeit werden an das VUMC MIDL-Labor geliefert und eingefroren (-80 °C), bis die Nukleinsäure extrahiert ist. 1-Liter-Beutel mit BSS-Kochsalzlösung, die Augenflüssigkeit enthält, werden an das VUMC MIDL-Labor geliefert und in drei 10-ml-Falcon-Röhrchen aliquotiert und dann eingefroren (-80 °C), bis die Nukleinsäure extrahiert ist.

Nukleinsäureextraktion:

• Bei den Proben wird die gesamte RNA und DNA auf den automatisierten Nukleinsäure-Extraktionsplattformen easyMAG, EMAG oder EZ1 extrahiert.

Echtzeit-RT-PCR:

• In Nukleinsäureextrakten vorhandene RNA wird revers in cDNA transkribiert. Die Ziel-cDNA wird durch PCR amplifiziert und die Fluoreszenzemission des Ziels wird in Echtzeit gemessen und nachgewiesen. Zu den Zielen gehören die N1- und N2-Regionen des Nukleokapsid-Gens von SARS-CoV-2 sowie eine interne Kontrolle zur Überwachung einer ausreichenden Nukleinsäureextraktion und Abwesenheit von PCR-Inhibitoren: menschliche RNase P (RP). Ziel-Ct-Werte werden aus erkannten Proben aufgezeichnet.

Next Generation Sequencing (NGS):

• Illumina: Nukleinsäureextrakte werden einer gezielten SARS-CoV-2-Genomamplifikation durch Tiling-PCR unterzogen. Die Amplikons werden einer DNA-Bibliotheksvorbereitung, Barcode-Kennzeichnung und Qualitätskontrolle unterzogen. DNA-Bibliotheken werden auf MiSeq-Durchflusszellen geimpft und sequenziert. Lesevorgänge werden als FASTQ-Dateien ausgegeben.
• MinION: Die gesamten Nukleinsäureextrakte werden einer DNA-Bibliotheksvorbereitung, Barcode-Kennzeichnung und Qualitätskontrolle unterzogen. Für die metagenomische Tiefensequenzierung werden DNA-Bibliotheken auf MinION Mk1C- und Flongle-Durchflusszellen geimpft. Lesevorgänge und zugehörige Qualitätsdaten werden als FASTQ-Dateien ausgegeben.

Risiken

Die Studienverfahren sind mit minimalem Risiko verbunden, da sie an einem Auge durchgeführt werden, an dem aus medizinischen Gründen ein geplanter chirurgischer Eingriff durchgeführt wird. Das sichere und sterile Verfahren verringert das Risiko erheblich.

Meldung unerwünschter Ereignisse oder unerwarteter Probleme, die ein Risiko für Teilnehmer oder andere darstellen

Alle unerwünschten Ereignisse werden gemäß Richtlinien und Verfahren dem Vanderbilt Eye Institute und dem VUMC IRB gemeldet. Diese werden innerhalb einer Woche nach Eintritt eingereicht.

Studienabbruch/Abbruch

VUMC IRB wird über den Abbruch und den Abbruch der Studie informiert. Wir gehen davon aus, dass die Studie etwa ein Jahr dauern wird.

Datenanalyse:

Ct-Werte von RT-PCR-detektierten Proben werden verglichen und mit klinischen Daten korreliert. SARS-CoV-2-Sequenzen von Illumina- und MinION NGS-Plattformen werden auf Varianten analysiert und mit klinischen Daten korreliert. Nicht-SARS-CoV-2-Mikrobensequenzen werden analysiert und auf der Ebene der Mikrobenspezies identifiziert. Das „Mikrobiom“ der Augenflüssigkeit wird probenübergreifend verglichen und mit klinischen Daten korreliert.

Datenschutz-/Vertraulichkeitsprobleme

Patienteninformationen werden anonymisiert und in die REDCAP-Umfrage hochgeladen, um Vertraulichkeit und Datenschutz zu gewährleisten.

Nachverfolgung und Aufbewahrung von Aufzeichnungen

Die Laufzeit wird voraussichtlich ein Jahr betragen. Die Daten werden nach Abschluss der Studie sechs Monate lang aufbewahrt. Dieses wird anschließend vernichtet.