Le COVID-19 peut-il persister dans le liquide intraoculaire ?

Études animales et études humaines antérieures

D'autres modèles murins et félins de coronavirus ont montré une atteinte oculaire. Dans l'expérience de Robbins et al, des souris ont subi des injections intracamérulaires et intravitréennes de coronavirus murin. Dans les 3 jours, ceux qui ont reçu des injections dans l'AC ont démontré une variété de résultats tels que la kératite et l'uvéite antérieure ; tandis que ceux qui ont subi une injection intravitréenne avaient des lésions rétiniennes multicouches avec des cicatrices RPE et une atrophie rétinienne. Une maladie du SNC et/ou un décès sont survenus chez un tiers des personnes ayant reçu des injections intravitréennes. Des antigènes viraux ont été isolés de ces souris, mais il existe des preuves que des cellules immunitaires et des facteurs pro-inflammatoires contribuent également aux résultats de la rétinopathie. Ce modèle murin, connu sous le nom de rétinopathie CoV expérimentale, a été utilisé pour examiner la réponse immunitaire de l'hôte qui entraîne des lésions rétiniennes. Chats infectés par le virus de la péritonite infectieuse féline, un coronavirus félin, se manifestant par une conjonctivite, une uvéite antérieure pyogranulomateuse, une vascularite rétinienne, une choroïdite et un décollement de la rétine. Plus de 90% des chats avaient un antigène détecté dans la conjonctive.

Des virus tels que VZV, HSV et CMV et des parasites comme la toxoplasmose ont été isolés du liquide intraoculaire des yeux humains en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR), malgré des titres sériques normaux ou négatifs.

Recrutement/Randomisation

Ceux qui répondent aux critères d'inclusion auront la possibilité de participer à l'étude. Ils fourniront un consentement éclairé écrit conformément aux réglementations HIPAA et à l'approbation Vanderbilt IRB.

Procédures d'étude

• Patients sélectionnés pour l'étude :

  80 patients au total

  20 patients subissant une chirurgie oculaire qui sont COVID négatifs seront inclus en tant que patients témoins et subiront les mêmes procédures 60 patients subissant une chirurgie oculaire avec une infection COVID antérieure seront stratifiés en trois groupes selon le temps écoulé depuis le diagnostic : 3, 6, 12 mois ~ 20 patients par groupe.

  • Tous les patients recevront un prélèvement sur le vitré de l'œil opéré 0,1-0,2 ml de liquide. Cet échantillon frais sera acheminé au laboratoire à l'aide d'une étiquette marquée unique. Ceci sera effectué après la mise en place du trocart
  • À la fin de la chirurgie, le sac BSS sera acheminé au laboratoire en utilisant la même étiquette.
• Le consentement éclairé sera obtenu lors de la visite préopératoire à la clinique
• Les échantillons recevront une étiquette de couleur spéciale et seront acheminés au laboratoire du Dr Schmitz et du Dr Maris depuis le bloc opératoire

Analyses de laboratoire

Protocole de test de laboratoire VUMC MIDL :

• Échantillons : 100 à 200 ul de liquide vitré seront livrés au laboratoire VUMC MIDL et congelés (-80 °C) jusqu'à ce que l'acide nucléique soit extrait. Des sacs de 1 litre de solution saline BSS contenant du liquide oculaire seront livrés au laboratoire VUMC MIDL et aliquotés dans 3 tubes Falcon de 10 ml, puis congelés (-80 ° C) jusqu'à ce que l'acide nucléique soit extrait.

Extraction d'acide nucléique :

• L'ARN et l'ADN totaux des échantillons seront extraits sur les plateformes d'extraction automatisée d'acide nucléique easyMAG, EMAG ou EZ1.

RT-PCR en temps réel :

• L'ARN présent dans les extraits d'acide nucléique sera rétrotranscrit en ADNc. L'ADNc cible sera amplifié par PCR et l'émission de fluorescence cible sera mesurée et détectée en temps réel. Les cibles comprennent les régions N1 et N2 du gène de la nucléocapside du SRAS-CoV-2, et un contrôle interne pour surveiller l'extraction adéquate des acides nucléiques et l'absence d'inhibiteurs de la PCR : la RNase P (RP) humaine. Les valeurs Ct cibles seront enregistrées à partir des échantillons détectés.

Séquençage de nouvelle génération (NGS) :

• Illumina : Les extraits d'acide nucléique subiront une amplification ciblée du génome entier du SRAS-CoV-2 par PCR en mosaïque. Les amplicons feront l'objet d'une préparation de bibliothèque d'ADN, d'un codage à barres et d'un contrôle qualité. Les bibliothèques d'ADN seront inoculées sur des Flow Cells MiSeq et séquencées. Les lectures seront sorties sous forme de fichiers FASTQ.
• MinION : Les extraits totaux d'acide nucléique subiront la préparation d'une bibliothèque d'ADN, le codage à barres et le contrôle qualité. Les bibliothèques d'ADN seront inoculées sur des cellules de flux MinION Mk1C & Flongle pour un séquençage profond métagénomique. Les lectures et les données de qualité associées seront sorties sous forme de fichiers FASTQ.

Des risques

Les procédures de l'étude impliquent un risque minimal car elles sont réalisées dans un œil qui subit une intervention chirurgicale élective programmée pour des raisons médicales. La procédure sûre et stérile diminue considérablement le risque.

Signalement d'événements indésirables ou de problèmes imprévus impliquant un risque pour les participants ou d'autres personnes

Tout événement indésirable sera signalé au Vanderbilt Eye Institute et au VUMC IRB conformément à la politique et à la procédure. Ceux-ci seront soumis dans la semaine suivant l'événement.

Abandon/arrêt de l'étude

Le VUMC IRB sera informé du retrait et de l'arrêt de l'étude. Nous prévoyons que l'étude durera environ 1 an.

L'analyse des données:

Les valeurs Ct des échantillons détectés par RT-PCR seront comparées et corrélées avec les données cliniques. Les séquences SARS-CoV-2 des plateformes Illumina et MinION NGS seront analysées pour les variantes et corrélées avec les données cliniques. les séquences microbiennes non-SARS-CoV-2 seront analysées et identifiées au niveau de l'espèce microbienne. Le « microbiome » du liquide oculaire sera comparé entre les échantillons et corrélé avec les données cliniques.

Problèmes de vie privée/confidentialité

Les informations sur les patients seront anonymisées et téléchargées dans l'enquête REDCAP pour garantir la confidentialité et la confidentialité.

Suivi et conservation des dossiers

La durée prévue est d'un an. Les données seront conservées pendant six mois après la clôture de l'étude. Celle-ci sera détruite par la suite.