Kan COVID-19 aanhouden in intraoculaire vloeistof?

Dierstudies en eerdere menselijke studies

Andere muizen- en kattenmodellen van het coronavirus hebben oculaire betrokkenheid aangetoond. In het experiment van Robbins et al. ondergingen muizen intracamerale en intravitreale injecties met muizencoronavirus. Binnen 3 dagen vertoonden degenen met injecties in de AC een verscheidenheid aan bevindingen, zoals keratitis en anterieure uveïtis; terwijl degenen die een intravitreale injectie ondergingen meerlagige retinale laesies hadden met RPE-littekens en retinale atrofie. CZS-ziekte en/of overlijden kwamen voor bij een derde van degenen die intravitreale injecties kregen. Virale antigenen zijn geïsoleerd uit deze muizen, maar er zijn aanwijzingen dat immuuncellen en pro-inflammatoire factoren ook bijdragen aan de retinopathiebevindingen. Dit muriene model, bekend als Experimentele CoV-retinopathie, is gebruikt om de immuunrespons van de gastheer te onderzoeken die tot schade aan het netvlies leidt. Katten besmet met feline infectieus peritonitis virus, een katachtig coronavirus, gemanifesteerd met conjunctivitis, pyogranulomateuze anterieure uveïtis, retinale vasculitis, choroiditis en netvliesloslating. Bij meer dan 90% van de katten werd antigeen gedetecteerd in het bindvlies.

Virussen zoals VZV, HSV en CMV en parasieten zoals toxoplasmose zijn geïsoleerd uit de intraoculaire vloeistof van menselijke ogen met behulp van de polymerasekettingreactie (PCR), ondanks dat ze normale of negatieve serumtiters hebben.

Inschrijving/Randomisatie

Degenen die aan de inclusiecriteria voldoen, krijgen de kans om deel te nemen aan het onderzoek. Ze zullen schriftelijke geïnformeerde toestemming geven in overeenstemming met de HIPAA-voorschriften en de goedkeuring van de Vanderbilt IRB.

Studie Procedures

• Patiënten geselecteerd voor studie:

  80 totale patiënten

  20 patiënten die oogchirurgie ondergaan die COVID-negatief zijn, worden opgenomen als controlepatiënten en ondergaan dezelfde procedures 60 patiënten die oogchirurgie ondergaan met eerdere COVID-infectie zullen worden gestratificeerd in drie groepen naar tijd sinds diagnose: 3, 6, 12 maanden ~ 20 patiënten per groep.

  • Alle patiënten krijgen een glasvochtaftakking van operatieoog 0.1-0.2 ml vloeistof. Dit verse monster wordt met een uniek gemarkeerd label naar het laboratorium gebracht. Dit wordt uitgevoerd nadat de trocar is geplaatst
  • Aan het einde van de operatie wordt de BSS-zak met hetzelfde label naar het laboratorium gebracht.
• Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen tijdens het pre-operatieve bezoek aan de kliniek
• Monsters krijgen een speciaal gekleurd label en worden via een buisje naar het laboratorium van Dr. Schmitz en Dr. Maris gestuurd vanuit de OK

Laboratorium analyses

VUMC MIDL Lab-testprotocol:

• Specimens: 100-200 µl droge kranen glasvocht worden geleverd aan het VUMC MIDL-laboratorium en ingevroren (-80°C) totdat het nucleïnezuur is geëxtraheerd. Zakken van 1 liter BSS-zoutoplossing met oogvloeistof worden geleverd aan het VUMC MIDL-laboratorium en verdeeld in 3 falcon-buisjes van 10 ml en vervolgens ingevroren (-80°C) totdat het nucleïnezuur is geëxtraheerd.

Nucleïnezuur extractie:

• Van monsters wordt totaal RNA en DNA geëxtraheerd op de easyMAG-, EMAG- of EZ1-platforms voor geautomatiseerde nucleïnezuurextractie.

Realtime RT-PCR:

• RNA dat aanwezig is in nucleïnezuurextracten zal omgekeerd worden getranscribeerd in cDNA. Doel-cDNA wordt geamplificeerd door PCR en doelfluorescentie-emissie wordt in realtime gemeten en gedetecteerd. Doelwitten zijn onder meer de N1- en N2-regio's van het nucleocapside-gen van SARS-CoV-2, en een interne controle om te controleren op adequate nucleïnezuurextractie en afwezigheid van PCR-remmers: humaan RNase P (RP). Doel-Ct-waarden worden geregistreerd van gedetecteerde monsters.

Next Generation Sequencing (NGS):

• Illumina: Nucleïnezuurextracten zullen gerichte SARS-CoV-2-hele-genoomamplificatie ondergaan door middel van tegel-PCR. Amplicons ondergaan voorbereiding van de DNA-bibliotheek, streepjescode en QC. DNA-bibliotheken zullen worden geïnoculeerd op MiSeq-stroomcellen en de sequentie wordt bepaald. Reads worden uitgevoerd als FASTQ-bestanden.
• MinION: Totale nucleïnezuurextracten ondergaan voorbereiding van de DNA-bibliotheek, streepjescode en QC. DNA-bibliotheken zullen worden geïnoculeerd op MinION Mk1C & Flongle-stroomcellen voor metagenomische diepe sequencing. Reads en bijbehorende kwaliteitsgegevens worden uitgevoerd als FASTQ-bestanden.

Risico's

De onderzoeksprocedures brengen een minimaal risico met zich mee, aangezien ze worden uitgevoerd in een oog dat om medische redenen een electieve geplande operatieve ingreep ondergaat. De veilige en steriele procedure verkleint het risico aanzienlijk.

Melding van ongewenste voorvallen of onverwachte problemen die risico's met zich meebrengen voor deelnemers of anderen

Alle ongewenste voorvallen worden gerapporteerd aan het Vanderbilt Eye Institute en VUMC IRB volgens beleid en procedure. Deze worden binnen een week na het optreden ingediend.

Studie stopzetting/stopzetting

VUMC IRB wordt op de hoogte gebracht van stopzetting en stopzetting van de studie. We verwachten dat het onderzoek ongeveer 1 jaar zal duren.

Gegevensanalyse:

Ct-waarden van RT-PCR gedetecteerde monsters zullen worden vergeleken en gecorreleerd met klinische gegevens. SARS-CoV-2-sequenties van Illumina- en MinION NGS-platforms zullen worden geanalyseerd op varianten en worden gecorreleerd met klinische gegevens. niet-SARS-CoV-2 microbiële sequenties zullen worden geanalyseerd en geïdentificeerd tot op het niveau van de microbiële soort. Het 'microbioom' van de oogvloeistof zal worden vergeleken tussen monsters en gecorreleerd met klinische gegevens.

Problemen met privacy/vertrouwelijkheid

Patiëntinformatie wordt geanonimiseerd en geüpload naar de REDCAP-enquête om vertrouwelijkheid en privacy te waarborgen.

Opvolging en recordbehoud

De looptijd is naar verwachting een jaar. De gegevens worden zes maanden na afsluiting van het onderzoek bewaard. Deze wordt daarna vernietigd.