O COVID-19 pode persistir no fluido intraocular?

Estudos Animais e Estudos Humanos Anteriores

Outros modelos murinos e felinos de coronavírus mostraram envolvimento ocular. No experimento de Robbins et al, camundongos foram submetidos a injeções intracamerais e intravítreas com coronavírus murino. Dentro de 3 dias, aqueles com injeções no AC demonstraram uma variedade de achados, como ceratite e uveíte anterior; enquanto aqueles que foram submetidos à injeção intravítrea apresentaram lesões retinianas multicamadas com cicatrizes no EPR e atrofia retiniana. Doença do SNC e/ou morte ocorreram em um terço daqueles com injeções intravítreas. Antígenos virais foram isolados desses camundongos, mas há evidências de que células imunes e fatores pró-inflamatórios também contribuem para os achados de retinopatia. Este modelo murino, conhecido como Retinopatia CoV Experimental, foi usado para examinar a resposta imune do hospedeiro que leva a danos na retina. Gatos infectados pelo vírus da peritonite infecciosa felina, um coronavírus felino, manifestam-se com conjuntivite, uveíte anterior piogranulomatosa, vasculite retiniana, coroidite e descolamento de retina. Mais de 90% dos gatos tiveram antígeno detectado na conjuntiva.

Vírus como VZV, HSV e CMV e parasitas como a toxoplasmose foram isolados do líquido intraocular de olhos humanos por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), apesar de apresentarem títulos séricos normais ou negativos.

Inscrição/Randomização

Aqueles que atenderem aos critérios de inclusão terão a oportunidade de participar do estudo. Eles fornecerão consentimento informado por escrito de acordo com os regulamentos da HIPAA e a aprovação do Vanderbilt IRB.

Procedimentos de estudo

• Pacientes selecionados para estudo:

  80 pacientes no total

  20 pacientes submetidos a cirurgia ocular que são COVID negativos serão incluídos como pacientes de controle e submetidos aos mesmos procedimentos 60 pacientes submetidos a cirurgia ocular com infecção prévia por COVID serão estratificados em três grupos por tempo desde o diagnóstico: 3, 6, 12 meses ~ 20 pacientes por grupo.

  • Todos os pacientes receberão uma punção vítrea do olho operatório 0,1-0,2 ml de líquido. Esta amostra fresca será enviada ao laboratório usando um rótulo marcado exclusivo. Isso será realizado após o trocater ser colocado
  • Ao final da cirurgia, a bolsa BSS será enviada ao laboratório com a mesma etiqueta.
• O consentimento informado será obtido durante a visita clínica pré-operatória
• As amostras receberão um rótulo de cor especial e serão enviadas para o laboratório Dr. Schmitz e Dr. Maris da sala de cirurgia

Análises laboratoriais

Protocolo de teste de laboratório VUMC MIDL:

• Amostras: torneiras secas de 100-200ul de fluido vítreo serão entregues ao laboratório VUMC MIDL e congeladas (-80C) até que o ácido nucleico seja extraído. Sacos de 1L de solução salina BSS contendo fluido ocular serão entregues ao laboratório VUMC MIDL e aliquotados em 3 tubos falcon de 10ml e depois congelados (-80C) até que o ácido nucleico seja extraído.

Extração de ácido nucleico:

• As amostras terão RNA e DNA totais extraídos nas plataformas automatizadas de extração de ácido nucleico easyMAG, EMAG ou EZ1.

RT-PCR em tempo real:

• O RNA presente nos extratos de ácidos nucléicos será transcrito reversamente em cDNA. O cDNA alvo será amplificado por PCR e a emissão de fluorescência alvo será medida e detectada em tempo real. Os alvos incluem as regiões N1 e N2 do gene do nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 e um controle interno para monitorar a extração adequada de ácido nucleico e a ausência de inibidores de PCR: RNase P humana (RP). Os valores alvo de Ct serão registrados a partir das amostras detectadas.

Sequenciamento de Próxima Geração (NGS):

• Illumina: Os extratos de ácidos nucleicos passarão por amplificação direcionada do genoma inteiro do SARS-CoV-2 por PCR de ladrilhos. Amplicons passarão por preparação de biblioteca de DNA, código de barras e controle de qualidade. As bibliotecas de DNA serão inoculadas em células de fluxo MiSeq e sequenciadas. As leituras serão geradas como arquivos FASTQ.
• MinION: Extratos totais de ácido nucleico passarão por preparação de biblioteca de DNA, código de barras e controle de qualidade. Bibliotecas de DNA serão inoculadas em células de fluxo MinION Mk1C & Flongle para sequenciamento metagenômico profundo. Leituras e dados de qualidade associados serão produzidos como arquivos FASTQ.

riscos

Os procedimentos do estudo envolvem risco mínimo, pois são realizados em um olho que está passando por um procedimento cirúrgico eletivo agendado por motivos médicos. O procedimento seguro e estéril diminui muito o risco.

Notificação de eventos adversos ou problemas imprevistos envolvendo risco para participantes ou outros

Quaisquer eventos adversos serão relatados ao Vanderbilt Eye Institute e ao VUMC IRB por política e procedimento. Estes serão enviados dentro de uma semana após a ocorrência.

Retirada/descontinuação do estudo

O VUMC IRB será notificado sobre a retirada e descontinuação do estudo. Prevemos que o estudo dure aproximadamente 1 ano.

Análise de dados:

Os valores de Ct das amostras detectadas por RT-PCR serão comparados e correlacionados com dados clínicos. As sequências de SARS-CoV-2 das plataformas Illumina e MinION NGS serão analisadas quanto a variantes e correlacionadas com dados clínicos. as sequências microbianas não SARS-CoV-2 serão analisadas e identificadas ao nível da espécie microbiana. O 'microbioma' do fluido ocular será comparado entre amostras e correlacionado com dados clínicos.

Questões de privacidade/confidencialidade

As informações do paciente serão desidentificadas e carregadas na pesquisa REDCAP para garantir confidencialidade e privacidade.

Acompanhamento e retenção de registros

A duração prevista é de um ano. Os dados serão retidos por seis meses após o encerramento do estudo. Isso será destruído depois.