Czy COVID-19 może przetrwać w płynie wewnątrzgałkowym?

Badania na zwierzętach i poprzednie badania na ludziach

Inne modele koronawirusa u myszy i kotów wykazały zajęcie oka. W eksperymencie Robbinsa i wsp. myszom podawano zastrzyki z mysiego koronawirusa do komory przedniej oka i ciała szklistego. W ciągu 3 dni osoby z zastrzykami do AC wykazały różne objawy, takie jak zapalenie rogówki i zapalenie przedniego odcinka błony naczyniowej oka; mając na uwadze, że osoby, które przeszły wstrzyknięcie do ciała szklistego, miały wielowarstwowe zmiany w siatkówce z bliznowaceniem RPE i zanikiem siatkówki. Choroby OUN i/lub zgony wystąpiły u jednej trzeciej osób po wstrzyknięciu doszklistkowym. Antygeny wirusowe zostały wyizolowane z tych myszy, ale istnieją dowody na to, że komórki odpornościowe i czynniki prozapalne również przyczyniają się do wyników retinopatii. Ten mysi model, znany jako eksperymentalna retinopatia CoV, został wykorzystany do zbadania odpowiedzi immunologicznej gospodarza, która prowadzi do uszkodzenia siatkówki. Koty zakażone wirusem zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, kocim koronawirusem, objawiającym się zapaleniem spojówek, piogranulomatycznym zapaleniem przedniego odcinka błony naczyniowej oka, zapaleniem naczyń siatkówki, zapaleniem naczyniówki i odwarstwieniem siatkówki. Ponad 90% kotów miało wykryty antygen w spojówce.

Wirusy, takie jak VZV, HSV i CMV, oraz pasożyty, takie jak toksoplazmoza, zostały wyizolowane z płynu wewnątrzgałkowego ludzkich oczu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), pomimo posiadania prawidłowych lub ujemnych mian w surowicy.

Rejestracja/Randomizacja

Ci, którzy spełnią kryteria włączenia, otrzymają możliwość udziału w badaniu. Dostarczą pisemną świadomą zgodę zgodnie z przepisami HIPAA i zatwierdzeniem Vanderbilt IRB.

Procedury Studiów

• Pacjenci wybrani do badania:

  łącznie 80 pacjentów

  20 pacjentów poddawanych zabiegom okulistycznym z ujemnym wynikiem COVID zostanie włączonych do grupy kontrolnej i poddanych tym samym zabiegom 60 pacjentów poddawanych zabiegom okulistycznym z wcześniejszą infekcją COVID zostanie podzielonych na trzy grupy według czasu od rozpoznania: 3, 6, 12 miesięcy ~ 20 pacjentów na Grupa.

  • Wszyscy pacjenci otrzymają nakłucie ciała szklistego z oka operacyjnego 0,1-0,2 ml płynu. Ta świeża próbka zostanie dostarczona do laboratorium za pomocą unikalnej oznaczonej etykiety. Zostanie to wykonane po umieszczeniu trokara
  • Pod koniec operacji worek BSS zostanie przesłany do laboratorium przy użyciu tej samej etykiety.
• Świadoma zgoda zostanie uzyskana podczas przedoperacyjnej wizyty w klinice
• Próbki otrzymają etykietę w specjalnym kolorze i zostaną przesłane do laboratorium dr Schmitz i dr Maris z sali operacyjnej

Analizy laboratoryjne

Protokół testów laboratoryjnych VUMC MIDL:

• Próbki: 100-200 µl suchej porcji płynu szklistego zostanie dostarczone do laboratorium VUMC MIDL i zamrożone (-80°C) do czasu ekstrakcji kwasu nukleinowego. Worki o pojemności 1 l z solą fizjologiczną BSS zawierające płyn oczny zostaną dostarczone do laboratorium VUMC MIDL i podzielone na porcje do 3 10 ml probówek Falcon, a następnie zamrożone (-80°C) do momentu ekstrakcji kwasu nukleinowego.

Ekstrakcja kwasu nukleinowego:

• Z próbek zostanie wyekstrahowany całkowity RNA i DNA na zautomatyzowanych platformach do ekstrakcji kwasów nukleinowych easyMAG, EMAG lub EZ1.

RT-PCR w czasie rzeczywistym:

• RNA obecne w ekstraktach kwasu nukleinowego zostanie poddane odwrotnej transkrypcji do cDNA. Docelowy cDNA zostanie zamplifikowany metodą PCR, a docelowa emisja fluorescencji zostanie zmierzona i wykryta w czasie rzeczywistym. Cele obejmują regiony N1 i N2 genu nukleokapsydu SARS-CoV-2 oraz kontrolę wewnętrzną do monitorowania odpowiedniej ekstrakcji kwasu nukleinowego i nieobecności inhibitorów PCR: ludzkiej RNazy P (RP). Docelowe wartości Ct zostaną zapisane z wykrytych próbek.

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS):

• Illumina: Ekstrakty kwasu nukleinowego zostaną poddane ukierunkowanej amplifikacji całego genomu SARS-CoV-2 poprzez kafelkowanie PCR. Amplikony zostaną poddane przygotowaniu biblioteki DNA, kodowaniu kreskowemu i kontroli jakości. Biblioteki DNA zostaną zaszczepione na komórkach przepływowych MiSeq i zsekwencjonowane. Odczyty będą wysyłane jako pliki FASTQ.
• MinION: Całkowite ekstrakty kwasów nukleinowych zostaną poddane przygotowaniu biblioteki DNA, kodowaniu kreskowemu i kontroli jakości. Biblioteki DNA zostaną zaszczepione na komórkach przepływowych MinION Mk1C i Flongle w celu głębokiego sekwencjonowania metagenomicznego. Odczyty i powiązane dane dotyczące jakości zostaną wygenerowane jako pliki FASTQ.

Ryzyka

Procedury badawcze wiążą się z minimalnym ryzykiem, ponieważ są wykonywane w oku, które przechodzi planowy planowy zabieg operacyjny z powodów medycznych. Bezpieczna i sterylna procedura znacznie zmniejsza ryzyko.

Zgłaszanie zdarzeń niepożądanych lub nieoczekiwanych problemów związanych z ryzykiem dla uczestników lub innych osób

Wszelkie zdarzenia niepożądane będą zgłaszane do Vanderbilt Eye Institute i VUMC IRB zgodnie z polityką i procedurą. Zostaną one przesłane w ciągu tygodnia od zdarzenia.

Wycofanie się/przerwanie badania

VUMC IRB zostanie powiadomiony o wycofaniu i przerwaniu badania. Przewidujemy, że badanie potrwa około 1 roku.

Analiza danych:

Wartości Ct z próbek wykrytych metodą RT-PCR zostaną porównane i skorelowane z danymi klinicznymi. Sekwencje SARS-CoV-2 z platform Illumina i MinION NGS zostaną przeanalizowane pod kątem wariantów i skorelowane z danymi klinicznymi. sekwencje drobnoustrojów innych niż SARS-CoV-2 zostaną przeanalizowane i zidentyfikowane na poziomie gatunku drobnoustroju. „Mikrobiom” płynu ocznego zostanie porównany w różnych próbkach i skorelowany z danymi klinicznymi.

Kwestie prywatności/poufności

Dane pacjenta zostaną pozbawione elementów umożliwiających identyfikację i przesłane do ankiety REDCAP w celu zapewnienia poufności i prywatności.

Kontynuacja i przechowywanie rekordów

Przewiduje się, że czas trwania to jeden rok. Dane będą przechowywane przez sześć miesięcy po zamknięciu badania. To zostanie później zniszczone.