Il COVID-19 può persistere nel fluido intraoculare?

Studi sugli animali e precedenti studi sull'uomo

Altri modelli murini e felini di coronavirus hanno mostrato coinvolgimento oculare. Nell'esperimento di Robbins et al, i topi sono stati sottoposti a iniezioni intracamerali e intravitreali con coronavirus murino. Entro 3 giorni, quelli con iniezioni nell'AC hanno mostrato una varietà di risultati come cheratite e uveite anteriore; mentre coloro che hanno subito l'iniezione intravitreale presentavano lesioni retiniche multistrato con cicatrici RPE e atrofia retinica. La malattia e/o la morte del sistema nervoso centrale si sono verificate in un terzo di quelli da iniezioni intravitreali. Gli antigeni virali sono stati isolati da questi topi, ma ci sono prove che anche le cellule immunitarie e i fattori pro-infiammatori contribuiscono ai risultati della retinopatia. Questo modello murino, noto come retinopatia sperimentale da CoV, è stato utilizzato per esaminare la risposta immunitaria dell'ospite che porta al danno retinico. Gatti infetti da virus della peritonite infettiva felina, un coronavirus felino, che si manifesta con congiuntivite, uveite anteriore piogranulomatosa, vasculite retinica, coroidite e distacco di retina. Oltre il 90% dei gatti aveva l'antigene rilevato nella congiuntiva.

Virus come VZV, HSV e CMV e parassiti come la toxoplasmosi sono stati isolati dal fluido intraoculare degli occhi umani utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), nonostante abbiano titoli sierici normali o negativi.

Iscrizione/Randomizzazione

Coloro che soddisfano i criteri di inclusione avranno l'opportunità di partecipare allo studio. Forniranno il consenso informato scritto in conformità con i regolamenti HIPAA e l'approvazione di Vanderbilt IRB.

Procedure di studio

• Pazienti selezionati per lo studio:

  80 pazienti totali

  20 pazienti sottoposti a chirurgia oculare che sono COVID negativi saranno inclusi come pazienti di controllo e sottoposti alle stesse procedure 60 pazienti sottoposti a chirurgia oculare con pregressa infezione da COVID saranno stratificati in tre gruppi in base al tempo dalla diagnosi: 3, 6, 12 mesi ~ 20 pazienti per gruppo.

  • Tutti i pazienti riceveranno un prelievo vitreo dall'occhio operativo 0.1-0.2 liquido ml. Questo campione fresco verrà inviato al laboratorio utilizzando un'etichetta contrassegnata univoca. Questo verrà eseguito dopo che il trequarti è stato posizionato
  • Al termine dell'intervento, la sacca BSS verrà trasferita al laboratorio utilizzando la stessa etichetta.
• Il consenso informato sarà ottenuto durante la visita clinica preoperatoria
• I campioni riceveranno un'etichetta di colore speciale e verranno inviati al laboratorio del dottor Schmitz e del dottor Maris dalla sala operatoria

Analisi di laboratorio

Protocollo di test di laboratorio VUMC MIDL:

• Campioni: 100-200 ul di fluido vitreo saranno consegnati al laboratorio VUMC MIDL e congelati (-80°C) fino all'estrazione dell'acido nucleico. Sacche da 1 litro di soluzione salina BSS contenente fluido oculare verranno consegnate al laboratorio VUMC MIDL e aliquotate in 3 provette Falcon da 10 ml e quindi congelate (-80 ° C) fino all'estrazione dell'acido nucleico.

Estrazione dell'acido nucleico:

• I campioni avranno l'RNA e il DNA totali estratti sulle piattaforme di estrazione automatizzata dell'acido nucleico easyMAG, EMAG o EZ1.

RT-PCR in tempo reale:

• L'RNA presente negli estratti di acido nucleico sarà retrotrascritto in cDNA. Il cDNA target sarà amplificato mediante PCR e l'emissione di fluorescenza target sarà misurata e rilevata in tempo reale. Gli obiettivi includono le regioni N1 e N2 del gene nucleocapside di SARS-CoV-2 e un controllo interno per monitorare l'adeguata estrazione dell'acido nucleico e l'assenza di inibitori della PCR: RNasi P umana (RP). I valori Ct target verranno registrati dai campioni rilevati.

Sequenziamento di nuova generazione (NGS):

• Illumina: gli estratti di acido nucleico subiranno l'amplificazione mirata dell'intero genoma SARS-CoV-2 mediante tiling PCR. Gli ampliconi saranno sottoposti a preparazione della libreria del DNA, codici a barre e controllo di qualità. Le librerie di DNA saranno inoculate su celle a flusso MiSeq e sequenziate. Le letture verranno emesse come file FASTQ.
• MinION: gli estratti di acido nucleico totale saranno sottoposti a preparazione della libreria del DNA, codici a barre e controllo di qualità. Le librerie di DNA saranno inoculate su celle a flusso MinION Mk1C e Flongle per il sequenziamento metagenomico profondo. Le letture e i dati di qualità associati verranno emessi come file FASTQ.

Rischi

Le procedure dello studio comportano un rischio minimo poiché vengono eseguite in un occhio sottoposto a una procedura operativa programmata elettiva per motivi medici. La procedura sicura e sterile riduce notevolmente il rischio.

Segnalazione di eventi avversi o problemi imprevisti che comportano rischi per i partecipanti o altri

Eventuali eventi avversi verranno segnalati al Vanderbilt Eye Institute e al VUMC IRB in base alla politica e alla procedura. Questi saranno presentati entro una settimana dall'occorrenza.

Ritiro/interruzione dello studio

VUMC IRB verrà informato del ritiro e dell'interruzione dello studio. Prevediamo che lo studio durerà circa 1 anno.

Analisi dei dati:

I valori Ct dei campioni rilevati mediante RT-PCR saranno confrontati e correlati con i dati clinici. Le sequenze SARS-CoV-2 dalle piattaforme Illumina e MinION NGS saranno analizzate per le varianti e correlate con i dati clinici. sequenze microbiche non SARS-CoV-2 saranno analizzate e identificate a livello di specie microbiche. Il "microbioma" del fluido oculare sarà confrontato tra i campioni e correlato con i dati clinici.

Problemi di privacy/riservatezza

Le informazioni sui pazienti verranno rese anonime e caricate nel sondaggio REDCAP per garantire riservatezza e privacy.

Follow-up e conservazione dei record

La durata prevista è di un anno. I dati saranno conservati per sei mesi dopo la chiusura dello studio. Questo sarà distrutto in seguito.