¿Puede la COVID-19 persistir en el líquido intraocular?

Estudios en animales y estudios humanos previos

Otros modelos murinos y felinos de coronavirus han mostrado afectación ocular. En el experimento de Robbins et al, los ratones se sometieron a inyecciones intracamerales e intravítreas con coronavirus murino. Dentro de los 3 días, aquellos con inyecciones en la CA demostraron una variedad de hallazgos como queratitis y uveítis anterior; mientras que aquellos que se sometieron a inyección intravítrea tenían lesiones retinianas multicapa con cicatrización del EPR y atrofia retiniana. La enfermedad del SNC y/o la muerte ocurrieron en un tercio de los que recibieron inyecciones intravítreas. Se han aislado antígenos virales de estos ratones, pero hay evidencia de que las células inmunitarias y los factores proinflamatorios también contribuyen a los hallazgos de la retinopatía. Este modelo murino, conocido como Retinopatía Experimental por CoV, se ha utilizado para examinar la respuesta inmunitaria del huésped que provoca daños en la retina. Gatos infectados con el virus de la peritonitis infecciosa felina, un coronavirus felino, que se manifiesta con conjuntivitis, uveítis anterior piogranulomatosa, vasculitis retiniana, coroiditis y desprendimiento de retina. Más del 90% de los gatos tenían antígeno detectado en la conjuntiva.

Se han aislado virus como VZV, HSV y CMV y parásitos como Toxoplasmosis del líquido intraocular de ojos humanos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a pesar de tener títulos séricos normales o negativos.

Inscripción/aleatorización

Aquellos que cumplan con los criterios de inclusión tendrán la oportunidad de participar en el estudio. Proporcionarán un consentimiento informado por escrito de acuerdo con las regulaciones de HIPAA y la aprobación de Vanderbilt IRB.

Procedimientos de estudio

• Pacientes seleccionados para el estudio:

  80 pacientes totales

  20 pacientes sometidos a cirugía ocular que son COVID negativos se incluirán como pacientes de control y se someterán a los mismos procedimientos 60 pacientes sometidos a cirugía ocular con infección previa por COVID se estratificarán en tres grupos por tiempo desde el diagnóstico: 3, 6, 12 meses ~ 20 pacientes por grupo.

  • Todos los pacientes recibirán una punción vítrea del ojo operado 0.1-0.2 ml de líquido. Esta muestra fresca se enviará al laboratorio con una etiqueta marcada única. Esto se realizará después de colocar el trocar.
  • Al final de la cirugía, la bolsa de BSS se enviará al laboratorio con la misma etiqueta.
• Se obtendrá el consentimiento informado durante la visita clínica preoperatoria
• Las muestras recibirán una etiqueta de color especial y se enviarán a los laboratorios Dr. Schmitz y Dr. Maris desde el quirófano.

Análisis de laboratorio

Protocolo de pruebas de laboratorio VUMC MIDL:

• Muestras: se entregarán 100-200ul de muestras secas de líquido vítreo al laboratorio VUMC MIDL y se congelarán (-80C) hasta que se extraiga el ácido nucleico. Se entregarán bolsas de 1 litro de solución salina BSS que contienen líquido ocular al laboratorio VUMC MIDL y se dividirán en alícuotas en 3 tubos falcon de 10 ml y luego se congelarán (-80 °C) hasta que se extraiga el ácido nucleico.

Extracción de ácido nucleico:

• Las muestras tendrán el ARN y el ADN totales extraídos en las plataformas de extracción de ácido nucleico automatizadas easyMAG, EMAG o EZ1.

RT-PCR en tiempo real:

• El ARN presente en los extractos de ácido nucleico se transcribirá inversamente en ADNc. El ADNc objetivo se amplificará mediante PCR y la emisión de fluorescencia objetivo se medirá y detectará en tiempo real. Los objetivos incluyen las regiones N1 y N2 del gen de la nucleocápside del SARS-CoV-2 y un control interno para monitorear la extracción adecuada de ácidos nucleicos y la ausencia de inhibidores de PCR: RNasa P (RP) humana. Los valores de Ct objetivo se registrarán a partir de las muestras detectadas.

Secuenciación de próxima generación (NGS):

• Illumina: los extractos de ácido nucleico se someterán a una amplificación específica del genoma completo del SARS-CoV-2 mediante PCR en mosaico. Los amplicones se someterán a la preparación de la biblioteca de ADN, el código de barras y el control de calidad. Las bibliotecas de ADN se inocularán en células de flujo de MiSeq y se secuenciarán. Las lecturas se generarán como archivos FASTQ.
• MinION: los extractos de ácido nucleico total se someterán a la preparación de la biblioteca de ADN, el código de barras y el control de calidad. Las bibliotecas de ADN se inocularán en células de flujo MinION Mk1C y Flongle para la secuenciación metagenómica profunda. Las lecturas y los datos de calidad asociados se generarán como archivos FASTQ.

Riesgos

Los procedimientos del estudio implican un riesgo mínimo ya que se realizan en un ojo que se somete a un procedimiento quirúrgico programado electivo por razones médicas. El procedimiento seguro y estéril reduce en gran medida el riesgo.

Informe de eventos adversos o problemas imprevistos que impliquen riesgos para los participantes u otros

Cualquier evento adverso se informará al Vanderbilt Eye Institute y al VUMC IRB según la política y el procedimiento. Estos se presentarán dentro de una semana de la ocurrencia.

Retiro/Interrupción del estudio

Se notificará al VUMC IRB sobre el retiro y la interrupción del estudio. Anticipamos que el estudio durará aproximadamente 1 año.

Análisis de los datos:

Los valores de Ct de las muestras detectadas por RT-PCR se compararán y correlacionarán con los datos clínicos. Las secuencias de SARS-CoV-2 de las plataformas Illumina y MinION NGS se analizarán en busca de variantes y se correlacionarán con los datos clínicos. Las secuencias microbianas distintas del SARS-CoV-2 se analizarán e identificarán a nivel de especie microbiana. El 'microbioma' del líquido ocular se comparará entre muestras y se correlacionará con datos clínicos.

Problemas de privacidad/confidencialidad

La información del paciente se anonimizará y se cargará en la encuesta REDCAP para garantizar la confidencialidad y la privacidad.

Seguimiento y retención de registros

Se espera que la duración sea de un año. Los datos se conservarán durante los seis meses siguientes al cierre del estudio. Esto será destruido después.