Mikrochimärismus bei Patienten mit wiederkehrenden Schwangerschaftsverlusten

Nach Kenntnis der Forscher hat keine frühere Studie den Ursprung mikrochimärer Zellen bestimmt, und daher wird diese Pilotstudie eine neu entwickelte genetische Analyse verwenden, die DNA-Fragmente aus den männlichen mikrochimären Zellen mit DNA-Fragmenten der Söhne des RPL-Patienten vergleicht ) und ältere(r) Bruder(e).

Ziel der Pilotstudie ist es, die Funktionen und Kapazitäten eines neu entwickelten Gentests zur Identifizierung mikrochimärer Zellen zu bewerten. Eine Pilotstudie ist notwendig, um sicherzustellen, dass die in der genetischen Analyse analysierten DNA-Fragmente (Indels) genügend informative Unterschiede enthalten, um zwischen dem/den Sohn(s), der/den Tochter(n) und dem/den älteren Bruder/n zu unterscheiden, bevor diese Untersuchungen in einem eingeleitet werden können größere Stichprobe. Um sicherzustellen, dass der Test die Herkunft mikrochimärer Zellen unabhängig vom Geschlecht zwischen Verwandten und Beruf unterscheiden kann, werden sowohl die Töchter als auch die Söhne des Probanden in die Studie einbezogen, um das Vertrauen zu stärken, dass der Test über diese Fähigkeit verfügt.

10 sRPL und ihre älteren Brüder und ihr erstgeborenes Kind sind inbegriffen. Insgesamt enthalten: ca. 30.

Es werden nur sRPL einbezogen, deren Brüder und Kinder ebenfalls der Teilnahme zustimmen.

Dem sRPL-Patienten wird eine Blutprobe von 12 ml EDTA-Plasma entnommen. Vom älteren Bruder und Kind(ern) wird eine Austauschprobe der Mundschleimhaut entnommen.

Die Proben werden zentrifugiert und der Buffy Coat mit der DNA wird vom Patienten gesammelt und bei -80 °C gelagert. Um den im TSPY1-Gen auf dem Y-Chromosom lokalisierten Multi-Copy-DYS14-Marker nachzuweisen, wird eine Echtzeit-PCR-Analyse der extrahierten DNA mit einem für das Referenzgen spezifischen PCR-Mastermix durchgeführt.

Außerdem wird die extrahierte DNA mithilfe spezifischer Primer und der zugehörigen Sonden in einer Multiplex-PCR-Analyse amplifiziert. Die spezifischen Primer zielen auf die 10 verschiedenen Indels ab, was zu 10 PCR-Produkten mit nicht überlappenden Amplikongrößen führt. Nach den PCR-Analysen werden die Fragmente durch Kapillarelektrophorese mit GeneticAnalyzer und GeneMapper analysiert. Wenn Unterschiede festgestellt werden, wird eine qPCR-Analyse nur an Proben des Probanden mit Primern und Sonden durchgeführt, die für die Indelfragmente spezifisch sind, die nur entweder beim Kind oder beim älteren Bruder vorhanden sind. 12 Brunnen beladen mit 30.000 GE in jeder Vertiefung werden zusammen mit einer Kontrolle ohne Vorlage und einer Positivkontrolle, die 10 GE DNA enthält, die homozygot für die Allelvariante ist, gescreent.