Microquimerismo em pacientes com perdas gestacionais recorrentes

Para o conhecimento dos investigadores, nenhum estudo anterior determinou a origem das células microquiméricas e, portanto, este estudo piloto usará uma análise genética recém-desenvolvida que comparará fragmentos de DNA das células microquiméricas masculinas com fragmentos de DNA do(s) filho(s) do paciente RPL ) e irmão(s) mais velho(s).

O estudo piloto visa avaliar as funções e a capacidade de um teste genético recém-desenvolvido que identifica células microquiméricas. Um estudo piloto é necessário para garantir que os fragmentos de DNA (indels) analisados ​​na análise genética incluam diferenças informativas suficientes para distinguir entre filho(s), filha(s) e irmão(s) mais velho(s) antes que essas investigações possam ser iniciadas em um amostra maior. Para garantir que o teste possa distinguir a origem das células microquiméricas entre parentes e trabalhar independentemente do gênero, o estudo incluirá tanto a(s) filha(s) quanto o(s) filho(s) do probando para fortalecer a confiança de que o teste possui essa capacidade.

10 sRPL e seu(s) irmão(s) mais velho(s) e filho primogênito estão incluídos. total incluído: aprox. 30.

Apenas sRPL cujo(s) irmão(s) e filho(s) também consentem em participar, serão incluídos.

Amostra de sangue de 12 ml de plasma EDTA é coletada do paciente sRPL. Uma amostra de troca da mucosa oral é coletada do irmão mais velho e da(s) criança(s).

As amostras serão centrifugadas e o buffy coat contendo o DNA será coletado do paciente e armazenado a -80 °C. Para detectar o marcador DYS14 multicópia localizado no gene TSPY1 no cromossomo Y, uma análise de PCR em tempo real será realizada no DNA extraído com um mastermix de PCR específico para o gene de referência.

Além disso, o DNA extraído será amplificado usando primers específicos e suas sondas associadas em uma análise de PCR multiplex. Os primers específicos visam os 10 indels diferentes, levando a 10 produtos de PCR com tamanhos de amplicon não sobrepostos. Após as análises de PCR, os fragmentos são analisados ​​por eletroforese capilar usando GeneticAnalyzer e GeneMapper. Quando as diferenças são identificadas, uma análise qPCR é realizada em amostras apenas do probando com primers e sondas específicas para os fragmentos indel que estão presentes apenas na criança ou no irmão mais velho. 12 poços carregados com 30.000 Os GE em cada poço são rastreados juntamente com um controle sem modelo e um controle positivo contendo 10 GE de DNA homozigoto para a variante do alelo.