Microchimerisme bij patiënten met terugkerende zwangerschapsverliezen

Voor zover de onderzoekers weten, heeft geen eerdere studie de oorsprong van microchimere cellen bepaald en daarom zal deze pilootstudie een nieuw ontwikkelde genetische analyse gebruiken die DNA-fragmenten van de mannelijke microchimere cellen zal vergelijken met DNA-fragmenten van de zoon(s) van de RPL-patiënt. ) en oudere broer(s).

De pilootstudie heeft tot doel de functies en capaciteit te evalueren van een nieuw ontwikkelde genetische test die microchimere cellen identificeert. Een pilootstudie is nodig om er zeker van te zijn dat de in de genetische analyse geanalyseerde DNA-fragmenten (indels) voldoende informatieve verschillen bevatten om onderscheid te kunnen maken tussen de zoon(s), dochter(s) en de oudere broer(s) voordat deze onderzoeken kunnen worden gestart in een grotere steekproef. Om er zeker van te zijn dat de test de oorsprong van microchimere cellen kan onderscheiden tussen familieleden en werk onafhankelijk van geslacht, zal het onderzoek zowel de dochter(s) als de zoon(s) van de proband omvatten om het vertrouwen te versterken dat de test dit vermogen bezit.

10 sRPL en hun oudere broer(s) en eerstgeboren kind zijn inbegrepen. totaal inbegrepen: ongeveer 30.

Alleen sRPL waarvan broer(s) en kind(eren) ook toestemming geven om deel te nemen, worden opgenomen.

Bij de sRPL-patiënt wordt een bloedmonster van 12 ml EDTA-plasma afgenomen. Bij de oudere broer en kind(eren) wordt een ruilmonster van het mondslijmvlies afgenomen.

De monsters worden gecentrifugeerd en de buffy coat met het DNA wordt bij de patiënt afgenomen en bij -80 °C bewaard. Om de DYS14-marker met meerdere kopieën in het TSPY1-gen op het Y-chromosoom te detecteren, zal een real-time PCR-analyse worden uitgevoerd op het geëxtraheerde DNA met een PCR-mastermix die specifiek is voor het referentiegen.

Ook zal het geëxtraheerde DNA worden geamplificeerd met behulp van specifieke primers en de bijbehorende probes in een multiplex PCR-analyse. De specifieke primers richten zich op de 10 verschillende indels die leiden tot 10 PCR-producten met niet-overlappende amplicongroottes. Na de PCR-analyses worden de fragmenten geanalyseerd door middel van capillaire elektroforese met behulp van GeneticAnalyzer en GeneMapper. Wanneer verschillen worden geïdentificeerd, wordt een qPCR-analyse uitgevoerd op monsters van alleen de proband met primers en sondes die specifiek zijn voor de indel-fragmenten die alleen aanwezig zijn in het kind of de oudere broer. 12 putten geladen met 30.000 GE in elk putje wordt gescreend samen met een controle zonder matrijs en een positieve controle die 10 GE DNA bevat dat homozygoot is voor de allelvariant.