Mikrochimeryzm u pacjentek z nawracającymi stratami ciąży

Zgodnie z wiedzą badaczy żadne wcześniejsze badanie nie określiło pochodzenia komórek mikrochimerycznych, dlatego w tym badaniu pilotażowym wykorzystana zostanie nowo opracowana analiza genetyczna, która porówna fragmenty DNA z męskich komórek mikrochimerycznych z fragmentami DNA syna(ów) pacjenta z RPL ) i starszy brat (braci).

Badanie pilotażowe ma na celu ocenę funkcji i możliwości nowo opracowanego testu genetycznego identyfikującego komórki mikrochimeryczne. Konieczne jest przeprowadzenie badania pilotażowego, aby upewnić się, że fragmenty DNA (indele) analizowane w ramach analizy genetycznej zawierają wystarczającą ilość informacji do rozróżnienia między synem(ami), córką(ami) i starszym bratem(ami), zanim badania te będą mogły zostać rozpoczęte w większa próbka. Aby upewnić się, że test może rozróżnić pochodzenie komórek mikrochimerycznych między krewnymi i pracą niezależnie od płci, Badanie obejmie zarówno córkę (córki), jak i syna (synów) probanta, aby wzmocnić pewność, że test posiada tę zdolność.

10 sRPL i ich starszy brat (bracia) oraz pierworodne dziecko jest włączone. łącznie: ok. 30.

Tylko sRPL, których brat (bracia) i dziecko (dzieci) również wyrażą zgodę na udział, zostaną uwzględnieni.

Próbkę krwi 12 ml osocza EDTA pobiera się od pacjenta sRPL. Od starszego brata i dziecka (dzieci) pobiera się wymienną próbkę błony śluzowej jamy ustnej.

Próbki zostaną odwirowane, a kożuszek leukocytarny zawierający DNA zostanie pobrany od pacjenta i przechowywany w temperaturze -80°C. W celu wykrycia wielokopiowego markera DYS14 zlokalizowanego w genie TSPY1 na chromosomie Y, wyekstrahowany DNA zostanie poddany analizie PCR w czasie rzeczywistym z mastermiksem PCR specyficznym dla genu referencyjnego.

Ponadto wyekstrahowany DNA zostanie zamplifikowany przy użyciu specyficznych starterów i powiązanych z nimi sond w multipleksowej analizie PCR. Specyficzne startery celują w 10 różnych indeli, co prowadzi do 10 produktów PCR o nienakładających się rozmiarach amplikonów. Po analizie PCR fragmenty są analizowane za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu GeneticAnalyzer i GeneMapper. Po zidentyfikowaniu różnic przeprowadza się analizę qPCR na próbkach pochodzących tylko od probanda ze starterami i sondami specyficznymi dla fragmentów indel, które są obecne tylko u dziecka lub starszego brata. 12 studni załadowanych 30.000 GE w każdym dołku są przeszukiwane wraz z kontrolą bez matrycy i kontrolą pozytywną zawierającą 10 GE DNA homozygotycznego pod względem wariantu allelu.