Microchimerismo in pazienti con aborti ricorrenti

A conoscenza dei ricercatori, nessuno studio precedente ha determinato l'origine delle cellule microchimeriche e, pertanto, questo studio pilota utilizzerà un'analisi genetica di nuova concezione che confronterà i frammenti di DNA delle cellule microchimeriche maschili con i frammenti di DNA dei figli del paziente RPL ) e fratello(i) maggiore(i).

Lo studio pilota mira a valutare le funzioni e la capacità di un test genetico di nuova concezione che identifica le cellule microchimeriche. È necessario uno studio pilota per garantire che i frammenti di DNA (indels) analizzati nell'analisi genetica includano differenze informative sufficienti per distinguere tra figlio/i, figlia/e e fratello/i maggiore/i prima che queste indagini possano essere avviate in un campione più ampio. Per garantire che il test possa distinguere l'origine delle cellule microchimeriche tra parenti e lavoro indipendentemente dal genere, lo studio includerà sia la figlia (e) che il figlio (i) del probando per rafforzare la fiducia che il test possieda questa capacità.

10 sRPL e i loro fratelli maggiori e il primogenito sono inclusi. totale incluso: circa 30.

Saranno inclusi solo sRPL i cui fratelli e figli acconsentono a partecipare.

Campione di sangue di 12 ml di plasma EDTA viene prelevato dal paziente sRPL. Un campione di scambio dalla mucosa orale viene prelevato dal fratello maggiore e dal/i bambino/i.

I campioni saranno centrifugati e il buffy coat contenente il DNA sarà prelevato dal paziente e conservato a -80 °C. Per rilevare il marcatore multi-copia DYS14 localizzato nel gene TSPY1 sul cromosoma Y sarà eseguita un'analisi PCR in tempo reale sul DNA estratto con un mastermix PCR specifico per il gene di riferimento.

Inoltre, il DNA estratto sarà amplificato utilizzando primer specifici e le loro sonde associate in un'analisi PCR multiplex. I primer specifici prendono di mira i 10 diversi indel che portano a 10 prodotti PCR con dimensioni dell'amplicone non sovrapposte. Dopo le analisi PCR, i frammenti vengono analizzati mediante elettroforesi capillare utilizzando GeneticAnalyzer e GeneMapper. Quando vengono identificate differenze, viene eseguita un'analisi qPCR su campioni del solo probando con primer e sonde specifici per i frammenti indel che sono presenti solo nel bambino o nel fratello maggiore. 12 pozzi caricati con 30.000 I GE in ciascun pozzetto vengono sottoposti a screening insieme a un controllo senza templato e un controllo positivo contenente 10 GE di DNA omozigote per la variante allelica.