Validierung eines molekularen Tests zur Risikostratifizierung von Patienten mit Hochrisiko-Darmmetaplasie (GCEP2-Studie)

Ziele:

Das Hauptziel dieser Studie ist es festzustellen, ob ein angepasster molekularer Test prospektiv bei Patienten mit intestinaler Metaplasie (IM) eine Untergruppe von Patienten mit sehr hohem Risiko für Dysplasie oder Magenkrebs (GC) identifizieren kann. Die sekundären Ziele dieser Studie sind die Validierung des Vorhersagewerts einer Reihe von Blut-mikroRNA-Biomarkern zur Vorhersage des GC-Risikos sowie die Bestimmung der Genauigkeit des Nachweises einer Helicobacter-pylori-Infektion mithilfe der Sequenzierung der nächsten Generation und deren Vergleich mit der aktuellen Goldstandard, Harnstoff-Atemtest.

Studiendesign:

Eine internationale, multizentrische Kohorte zur Bewertung des klinischen Nutzens eines maßgeschneiderten molekularen Tests zur Identifizierung einer Untergruppe von IM-Patienten mit sehr hohem GC-Risiko. Zielrekrutierung sind 500 Probanden mit IM der OLGIM-Stufen 2 bis 4.

Da das aktualisierte Sydney-Biopsieprotokoll nicht routinemäßig für klinische Zwecke durchgeführt wird und die meisten Probanden rekrutiert werden, bevor ihre OLGIM-Einstufung zu Studienbeginn bestätigt wird, werden einige Probanden aus der Studie genommen, wenn festgestellt wird, dass sie keine IM haben oder als IM eingestuft wurden OLGIM Stufe 1, zu Studienbeginn OGD.

Die kooperierenden Zentren werden gebeten, die folgenden Proben mit zugehörigen demografischen und klinisch-pathologischen Daten bereitzustellen (wie im Fallberichtsformular angegeben): Schockgefrorenes Gewebe und FFPE-Gewebe aus der Antrumstelle für die DNA-Extraktion, Serum für H. pylori-Antikörpertests und miRNA-Profilierung und Buffy Coat für die DNA-Extraktion.

Einschreibung:

Patienten, die von Ermittlern während der Kliniken gesehen wurden, werden für die Aufnahme in Betracht gezogen.

Um die Anzahl der Probanden zu minimieren, die nach der Ausgangsendoskopie zurückgezogen werden, weil zu Studienbeginn nicht mindestens OLGIM der Stadien 2–4 nachgewiesen werden konnte, können Patienten mit mittelschwerer oder schwerer IM in der Vorgeschichte entweder im Antrum oder im Körper für die Rekrutierung priorisiert werden.

Grundlinie:

1. Fragebogen Die Probanden werden gebeten, einen grundlegenden Fragebogen auszufüllen, der Informationen über die Demografie, die persönliche Krankengeschichte, den Lebensstil und die Familiengeschichte von GC enthält. Klinische Daten und Identifikatoren werden erfasst.
2. Harnstoff-Atemtest Probanden fasten 6 Stunden oder über Nacht, bevor sie sich dem Harnstoff-Atemtest (UBT) unterziehen. Die Atementnahme wird vor der Einnahme von 13C-Harnstoff und 10 Minuten, 20 Minuten und 30 Minuten nach der Einnahme durchgeführt.
3. OGD und Biopsien

Die Probanden werden einer Basis-OGD unter hochauflösendem Weißlicht (1080p) und einer Biopsie unterzogen, um den OLGIM-Status zu ermitteln. Während des Verfahrens zur Validierung der Diagnose wird eine Videoaufzeichnung der OGD durchgeführt. Magenschleimhautbiopsien werden wie folgt entnommen:

• Je 1 Biopsie aus AL, AG, IA, BL, BG nach dem aktualisierten Sydney-System wird in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und zur histologischen Untersuchung eingeschickt
• 2 benachbarte Biopsien bei AL und 2 benachbarte Biopsien bei BL werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren

Die Standorte sind wie folgt definiert:

• AL - geringere Krümmung des Antrums, innerhalb von 2-3 cm des Pylorus
• AG - größere Krümmung des Antrums, innerhalb von 2-3 cm des Pylorus
• IA - Incisura Angularis
• BL - geringere Krümmung des Corpus, 4 cm proximal zum Angulus
• BG - mittlerer Teil der größeren Krümmung des Korpus, 8 cm von der Kardia entfernt

Sollte der Endoskopiker im Antrum und/oder Korpus vermutete IM-Bereiche feststellen, die sich innerhalb der oben definierten Standorte des aktualisierten Sydney-Systems befinden, sollten Biopsien zur histologischen Untersuchung sowie 2 benachbarte gefrorene Biopsien aus diesen vermuteten IM-Bereichen entnommen werden stattdessen.

Sollte der Endoskopiker im Antrum und/oder Korpus vermutete IM-Bereiche beobachten, die außerhalb der oben definierten Positionen des aktualisierten Sydney-Systems liegen, sollten stattdessen die beiden angrenzenden gefrorenen Biopsien aus diesen vermuteten IM-Bereichen entnommen werden.

Alle während der OGD identifizierten Schleimhautläsionen werden im Rahmen der normalen klinischen Praxis separat biopsiert und zur histopathologischen Beurteilung geschickt.

Gefrorene Biopsieproben werden in einer hochwertigen Gewebebank aufbewahrt.

Die Ermittler werden das obige Protokoll befolgen. Sie können jedoch vom Protokoll abweichen, wenn die Interessen des Patienten dies erfordern.

Blutentnahme, -verarbeitung und -analysen:

Jedem Probanden werden 20 ml Blut entnommen. Serum, Plasma und Buffy Coat werden extrahiert.

Histologische Beurteilung:

Alle Biopsieproben werden auf den Grad der chronischen Gastritis, atrophischen Gastritis, das Vorhandensein von H. pylori-Organismen, IM und Dysplasie untersucht. Diese werden mit dem aktualisierten Sydney-System bewertet. Das Vorhandensein von IM wird durch das Vorhandensein von Globet-Zellen basierend auf Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung oder Alcianblau (AB)-positiver Expression angezeigt und wird in leicht, mäßig und deutlich klassifiziert. Dysplasie wird nach der überarbeiteten Wiener Klassifikation eingestuft, und die Klassifikation von Karzinomen erfolgt gemäß der WHO-Klassifikation von Tumoren und dem AJCC-Staging-System. Der Prozentsatz der Magenepithelschleimhaut, die die Merkmale von IM in Biopsien zeigt, wird bewertet, um das OLGIM-Stadium abzuleiten.

Molekularer Test:

Drei genomische Hauptveränderungen – erhöhte Mutationshäufigkeiten, somatische Kopienzahlveränderungen (sCNAs) und Telomerverkürzung – wurden zuvor festgestellt, um Assoziationen mit dem Fortschreiten der Krankheit von IM zu Dysplasie oder GC oder der Persistenz von IM aufzuzeigen. Es wurde festgestellt, dass sich ein erheblicher Anteil der sCNAs in IM-Proben auf Chromosom 8q befindet, wo sich das Onkogen Myc befindet. Ein maßgeschneiderter molekularer Test wird basierend auf einem Panel entwickelt, das hauptsächlich auf genomische Regionen mit wiederkehrenden mutierten Genen und Chromosom 8q-Amplifikation bei IM-Patienten abzielt. Der angepasste Test zielt darauf ab, IM-Patienten weiter zu stratifizieren. Die gesamte genomische DNA wird aus Biopsien (gefrorenes Gewebe und FFPE) und passenden Blutproben extrahiert. Ein zielgerichtetes Gen-Panel wird angewendet, so dass spezifische genomische Regionen von Interesse erfasst werden, wodurch die Kosten und der Umfang der Datenanalyse erheblich reduziert werden. Die Bibliotheksvorbereitung wird unter Verwendung der Zielanreicherungsassays gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Mutationsrufe und Chromosom 8q-Amplifikation werden mit der Software Genome Analysis Toolkit (GATK) bestimmt. Probanden werden als testpositiv eingestuft, wenn eine somatische Variante mit mindestens 10 Varianten, die Reads unterstützen, oder eine Kopienzahlvariante mit einer segmentierten Mittelwertabdeckung von mindestens 2 Standardabweichungen vom kopienneutralen Mittelwert identifiziert wird.

miRNA-Profilierung: Gesamt-RNA aus Serum wird isoliert und in cDNA umgewandelt, die dann quantifiziert wird. Ziel-miRNA-Expressionsniveaus nach Normalisierung sowohl technischer als auch biologischer Variationen werden analysiert, um Panels von miRNAs mit der höchsten Unterscheidungskraft zwischen gesunden und kranken Zuständen zu identifizieren. Jedem Probanden wird basierend auf dem miRNA-Expressionsprofil eine Punktzahl zugewiesen, die auf die Möglichkeit eines GC hinweist. Das Ergebnis wird mit OGD und Histologie, dem Goldstandard für die Diagnose von GC, verglichen.

Nachverfolgen:

Die Probanden werden in der Klinik oder per Telefon nachverfolgt, um den Status in den Jahren 1 und 3 zu aktualisieren. Klinische Daten werden über einen Fragebogen erhoben. Ein Fensterzeitraum von 6 Monaten vor oder nach dem Jubiläums-Basis-OGD-Datum ist akzeptabel.

Die Probanden werden in den Jahren 2 und 4 einer OGD-Überwachung unterzogen, um zu beurteilen, ob der Proband den Endpunkt erreicht hat. Biopsien werden nach dem beschriebenen Protokoll entnommen. Klinische Daten werden über einen Fragebogen erhoben und die Datenbank aktualisiert. Ein Fensterzeitraum von 6 Monaten vor oder nach dem Jubiläums-Basis-OGD-Datum ist akzeptabel.

Die Probanden werden jährlich in der Klinik oder per Telefon nachverfolgt, um den Status für die Jahre 5-10 zu aktualisieren. Klinische Daten werden durch einen Fragebogen erhoben. Ein Fensterzeitraum von 6 Monaten vor oder nach dem Jubiläums-Basis-OGD-Datum ist akzeptabel. Sollte die Inzidenz von GC in oder nach Jahr 4 in der Kohorte ausreichen, um die Nullhypothese mit dem beschriebenen Signifikanz- und Aussagekraftniveau abzulehnen, kann die jährliche Nachsorge für die Jahre 5-10 eingestellt werden.

Berechnung der Stichprobengröße:

Die vorgeschlagene Stichprobengröße für die prospektive Kohortenstudie wurde unter Verwendung des Logrank-Tests für den Endpunkt „Zeit bis zur Progression“ geschätzt. Unter der Annahme einer 4-jährigen kumulativen Progressionsinzidenz von 10 % in der testpositiven Gruppe bzw. 3 % in der testnegativen Gruppe (d. h. Hazard Ratio, HR = 3,5), ist eine Stichprobengröße von 480 erforderlich, basierend auf einem Signifikanzniveau von 5 % und einer Trennschärfe von 85 %. Unter der Annahme einer Fluktuation von 5 % beträgt die Gesamtstichprobengröße 500.

Statistische Analyse:

Kategoriale Variablen werden mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Test nach Fisher analysiert. Kontinuierliche Variablen werden mit dem Student-t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test analysiert. Parameter mit einem P-Wert < 0,05 in der univariaten Analyse werden in die multivariate Analyse aufgenommen. Die multivariate Analyse wird unter Verwendung der Cox-Regressionsanalyse durchgeführt. P < 0,05 wird als statistisch signifikant angesehen.