Walidacja testu molekularnego do stratyfikacji ryzyka pacjentów z metaplazją jelitową wysokiego ryzyka (badanie GCEP2)

Cele:

Głównym celem tego badania jest ustalenie, czy zindywidualizowany test molekularny może zidentyfikować prospektywnie wśród pacjentów z metaplazją jelitową (IM) podgrupę pacjentów z bardzo wysokim ryzykiem dysplazji lub raka żołądka (GC). Drugorzędnymi celami tego badania jest walidacja wartości predykcyjnej panelu biomarkerów mikroRNA krwi do przewidywania ryzyka GC, a także określenie dokładności wykrywania zakażenia Helicobacter pylori przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji i porównanie go z obecnymi złoty standard, mocznikowy test oddechowy.

Projekt badania:

Międzynarodowa, wieloośrodkowa kohorta mająca na celu ocenę przydatności klinicznej dostosowanego testu molekularnego w celu zidentyfikowania podgrupy pacjentów domięśniowych z bardzo wysokim ryzykiem GC. Docelowa rekrutacja to 500 osób z IM etapu 2 do 4 OLGIM.

Ponieważ zaktualizowany protokół biopsji z Sydney nie jest rutynowo wykonywany do celów klinicznych, a większość uczestników zostanie zwerbowana przed potwierdzeniem początkowego stopnia zaawansowania OLGIM, niektórzy pacjenci zostaną wycofani z badania, jeśli zostanie wykryty brak IM lub zostanie oceniony jako IM. OLGIM Etap 1, na początku OGD.

Ośrodki współpracujące proszone są o dostarczenie następujących próbek wraz z powiązanymi danymi demograficznymi i kliniczno-patologicznymi (jak wskazano w formularzu opisu przypadku): tkanka szybko zamrożona i tkanka FFPE z miejsca antrum do ekstrakcji DNA, surowica do testu na przeciwciała H. pylori i profilowania miRNA i kożuszek leukocytarny do ekstrakcji DNA.

Zapisy:

Pacjenci obserwowani przez badaczy podczas klinik będą brani pod uwagę przy rejestracji.

Aby zminimalizować liczbę pacjentów, którzy zostali wycofani po wyjściowej endoskopii z powodu niewykrycia OLGIM co najmniej w stadium 2-4 na początku, pacjenci z umiarkowanym lub ciężkim IM w wywiadzie w antrum lub tułowiu mogą zostać potraktowani priorytetowo do rekrutacji.

Linia bazowa:

1. Kwestionariusz Pacjenci zostaną poproszeni o wypełnienie podstawowego kwestionariusza, dostarczającego informacji na temat danych demograficznych, osobistej historii medycznej, stylu życia i historii rodzinnej GC. Dane kliniczne i identyfikatory będą rejestrowane.
2. Urea Breath Test Osoby będą pościły przez 6 godzin lub całą noc przed poddaniem się mocznikowemu testowi oddechowemu (UBT). Pobieranie oddechu zostanie przeprowadzone przed spożyciem mocznika 13C oraz po 10 minutach, 20 minutach i 30 minutach po spożyciu.
3. OGD i biopsje

Uczestnicy zostaną poddani podstawowemu badaniu OGD w świetle białym o wysokiej rozdzielczości (1080p) oraz biopsji w celu ustalenia statusu OLGIM. Podczas procedury walidacji diagnozy zostanie przeprowadzony zapis wideo OGD. Biopsje błony śluzowej żołądka będą pobierane w następujący sposób:

• 1 biopsja każdego z AL, AG, IA, BL, BG zgodnie ze zaktualizowanym systemem Sydney zostanie utrwalona w 4% paraformaldehydzie (PFA) i wysłana do badania histologicznego
• 2 sąsiadujące biopsje w AL i 2 sąsiadujące biopsje w BL zostaną szybko zamrożone w ciekłym azocie

Lokalizacje są zdefiniowane w następujący sposób:

• AL - skrzywienie mniejsze odźwiernika w odległości 2-3 cm od odźwiernika
• AG - większa krzywizna antrum, w odległości 2-3 cm od odźwiernika
• IA - incisura angularis
• BL - krzywizna mniejsza korpusu, 4 cm proksymalnie od kąta
• BG - środkowy odcinek krzywizny większej korpusu, 8cm od wpustu

Jeśli endoskopista zaobserwuje podejrzane obszary IM w antrum i/lub korpusie, które znajdują się w wyżej zdefiniowanych lokalizacjach Zaktualizowanego Systemu Sydney, wówczas biopsje do badania histologicznego, jak również 2 sąsiadujące zamrożone biopsje, powinny zostać pobrane z tych podejrzanych obszarów IM Zamiast.

Jeśli endoskopista zaobserwuje podejrzane obszary IM w jamie ustnej i/lub korpusie, które znajdują się poza wyżej zdefiniowanymi lokalizacjami Zaktualizowanego Systemu Sydney, wtedy zamiast tego należy pobrać 2 sąsiadujące zamrożone biopsje z tych podejrzanych obszarów IM.

Wszystkie zmiany błony śluzowej stwierdzone podczas OGD zostaną poddane osobnej biopsji w ramach normalnej praktyki klinicznej i wysłane do oceny histopatologicznej.

Zamrożone próbki biopsji będą przechowywane w banku tkanek wysokiej jakości.

Śledczy będą postępować zgodnie z powyższym protokołem. Mogą jednak odbiegać od protokołu, jeśli wymaga tego interes pacjenta.

Pobieranie, przetwarzanie i analizy krwi:

Od każdego pacjenta zostanie pobrane 20 ml krwi. Zostanie pobrana surowica, osocze i kożuszek leukocytarny.

Ocena histologiczna:

Wszystkie próbki biopsji zostaną ocenione pod kątem stopnia przewlekłego zapalenia błony śluzowej żołądka, zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka, obecności organizmów H. pylori, im i dysplazji. Zostaną one ocenione przy użyciu zaktualizowanego systemu Sydney. Obecność IM jest wskazywana przez obecność komórek kulistych na podstawie barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) lub pozytywną ekspresją błękitu Alcian (AB) i zostanie sklasyfikowana jako łagodna, umiarkowana i zaznaczona. Dysplazja będzie oceniana zgodnie z poprawioną klasyfikacją wiedeńską, a klasyfikacja raka będzie zgodna z klasyfikacją nowotworów WHO i systemem stopniowania AJCC. Procent błony śluzowej nabłonka żołądka wykazujący cechy IM w biopsjach zostanie oceniony w celu uzyskania stadium OLGIM.

Test molekularny:

Trzy główne zmiany genomowe - zwiększona częstość mutacji, zmiany liczby kopii somatycznych (sCNA) i skrócenie telomerów - zostały wcześniej ustalone, aby wykazać powiązania z progresją choroby IM do dysplazji lub GC lub utrzymywaniem się IM. Stwierdzono, że znaczna część sCNA w próbkach IM znajduje się na chromosomie 8q, gdzie rezyduje onkogen Myc. Zindywidualizowany test molekularny zostanie opracowany w oparciu o panel ukierunkowany przede wszystkim na regiony genomowe z powtarzającymi się mutacjami genów i amplifikacją chromosomu 8q u pacjentów z IM. Zindywidualizowany test ma na celu dalszą stratyfikację pacjentów IM. Całkowity genomowy DNA zostanie wyekstrahowany z biopsji (tkanka zamrożona i FFPE) i dopasowanych próbek krwi. Zastosowany zostanie ukierunkowany panel genów, aby uchwycić określone interesujące regiony genomowe, co znacznie obniży koszt i ilość analizy danych. Przygotowanie biblioteki zostanie przeprowadzone przy użyciu testów wzbogacenia celu zgodnie z instrukcjami producenta. Wywołania mutacji i amplifikacja chromosomu 8q zostaną określone przy użyciu oprogramowania Genome Analysis Toolkit (GATK). Osobnicy są klasyfikowani jako test-pozytywni, jeśli zidentyfikowany zostanie wariant somatyczny z co najmniej 10 wariantami wspierającymi odczyty lub wariant liczby kopii z segmentowanym średnim pokryciem wynoszącym co najmniej 2 odchylenia standardowe od średniej neutralnej dla kopii.

Profilowanie miRNA: Całkowity RNA z surowicy jest izolowany i przekształcany w cDNA, który jest następnie oznaczany ilościowo. Docelowe poziomy ekspresji miRNA po normalizacji zmienności zarówno technicznej, jak i biologicznej są analizowane w celu zidentyfikowania paneli miRNA o najwyższej sile dyskryminacyjnej między stanem zdrowym a stanem chorobowym. Każdemu pacjentowi zostanie przypisana ocena oparta na profilu ekspresji miRNA, wskazująca na możliwość posiadania GC. Wynik zostanie porównany z OGD i histologią, która jest złotym standardem w diagnostyce GC.

Podejmować właściwe kroki:

Pacjenci będą obserwowani w klinice lub telefonicznie w celu aktualizacji statusu w 1. i 3. roku. Dane kliniczne zostaną zebrane za pomocą kwestionariusza. Akceptowalny jest okres okna wynoszący 6 miesięcy przed lub po rocznicowej dacie bazowej OGD.

Uczestnicy zostaną poddani obserwacji OGD w 2. i 4. roku życia, aby ocenić, czy osiągnęli punkt końcowy. Biopsje będą pobierane zgodnie z opisanym protokołem. Dane kliniczne zostaną zebrane za pomocą kwestionariusza, a baza danych zostanie zaktualizowana. Akceptowalny jest okres okna wynoszący 6 miesięcy przed lub po rocznicowej dacie bazowej OGD.

Pacjenci będą obserwowani co roku w klinice lub przez telefon w celu aktualizacji statusu dla lat 5-10. Dane kliniczne zostaną zebrane za pomocą kwestionariusza. Akceptowalny jest okres okna wynoszący 6 miesięcy przed lub po rocznicowej dacie bazowej OGD. Jeśli częstość występowania GC w 4. roku lub później w kohorcie będzie wystarczająca do odrzucenia hipotezy zerowej z opisanym poziomem istotności i mocy, coroczna obserwacja dla lat 5-10 może zostać przerwana.

Obliczenie wielkości próbki:

Proponowaną wielkość próby do prospektywnego badania kohortowego oszacowano za pomocą testu logrank dla wyniku czasu do progresji. Zakładając skumulowaną 4-letnią częstość występowania progresji wynoszącą odpowiednio 10% w grupie z pozytywnym wynikiem testu i 3% w grupie z ujemnym wynikiem testu (tj. współczynnik ryzyka, HR = 3,5), wymagana będzie próba o wielkości 480 w oparciu o poziom istotności 5% i moc 85%. Ponadto zakładając utratę 5%, całkowita wielkość próby wyniesie 500.

Analiza statystyczna:

Zmienne kategoryczne będą analizowane za pomocą testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera. Zmienne ciągłe będą analizowane za pomocą testu t-Studenta lub testu U Manna-Whitneya. Parametry o wartości P <0,05 w analizie jednoczynnikowej zostaną uwzględnione w analizie wielowymiarowej. Analiza wielowymiarowa zostanie przeprowadzona przy użyciu analizy regresji Coxa. P <0,05 uważa się za istotne statystycznie.