Convalida di un test molecolare per la stratificazione del rischio di pazienti con metaplasia intestinale ad alto rischio (studio GCEP2)

Obiettivi:

L'obiettivo principale di questo studio è determinare se un test molecolare personalizzato può identificare prospetticamente, all'interno di pazienti con metaplasia intestinale (IM), un sottogruppo di pazienti con rischio molto elevato di displasia o cancro gastrico (GC). Gli obiettivi secondari di questo studio sono convalidare il valore predittivo di un pannello di biomarcatori di microRNA del sangue per la previsione del rischio di GC, nonché determinare l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Helicobacter pylori utilizzando il sequenziamento di nuova generazione e confrontarlo con l'attuale gold standard, test del respiro dell'urea.

Disegno dello studio:

Una coorte internazionale multicentrica per valutare l'utilità clinica di un test molecolare personalizzato per identificare un sottogruppo di pazienti IM ad altissimo rischio di GC. Il reclutamento target è di 500 soggetti con IM di OLGIM Stage 2 a 4.

Poiché il protocollo di biopsia di Sydney aggiornato non viene eseguito di routine per scopi clinici e la maggior parte dei soggetti verrà reclutata prima di confermare la loro stadiazione OLGIM al basale, alcuni soggetti verranno ritirati dallo studio se viene rilevato che non hanno IM o IM valutato essere OLGIM Fase 1, al basale OGD.

I siti che collaborano sono pregati di fornire i seguenti campioni con i dati demografici e clinico-patologici associati (come indicato nel Case Report Form): tessuto congelato a scatto e tessuto FFPE dal sito dell'antro per l'estrazione del DNA, siero per il test degli anticorpi H. pylori e la profilazione del miRNA e buffy coat per l'estrazione del DNA.

Iscrizione:

I pazienti visti dagli investigatori durante le cliniche saranno presi in considerazione per l'arruolamento.

Per ridurre al minimo il numero di soggetti che vengono ritirati dopo l'endoscopia basale a causa del mancato rilevamento di almeno OLGIM di stadio 2-4 al basale, i pazienti con anamnesi di IM moderata o grave all'antro o al corpo possono avere la priorità per il reclutamento.

Linea di base:

1. Questionario Ai soggetti verrà chiesto di completare un questionario di base, fornendo informazioni su dati demografici, storia medica personale, stile di vita e storia familiare di GC. I dati clinici e gli identificatori saranno registrati.
2. I soggetti del test del respiro dell'urea digiuneranno per 6 ore o durante la notte prima di sottoporsi al test del respiro dell'urea (UBT). La raccolta del respiro verrà eseguita prima dell'ingestione di urea 13C e 10 minuti, 20 minuti e 30 minuti dopo l'ingestione.
3. OGD e biopsie

I soggetti saranno sottoposti a un OGD di base sotto luce bianca ad alta definizione (1080p) e biopsia per accertare lo stato OLGIM. Durante la procedura di validazione della diagnosi verrà effettuata una videoregistrazione dell'OGD. Le biopsie della mucosa gastrica saranno prelevate come segue:

• 1 biopsia ciascuno da AL, AG, IA, BL, BG secondo il Sydney System aggiornato verrà fissata in paraformaldeide al 4% (PFA) e inviata per l'esame istologico
• 2 biopsie adiacenti all'AL e 2 biopsie adiacenti al BL saranno congelate in azoto liquido

Le sedi sono definite come segue:

• AL - minore curvatura dell'antro, entro 2-3 cm dal piloro
• AG - maggiore curvatura dell'antro, entro 2-3 cm dal piloro
• IA - incisura angolare
• BL - minore curvatura del corpo, 4 cm prossimalmente all'angolo
• BG - porzione mediana della grande curvatura del corpo, a 8 cm dal cardias

Se l'endoscopista osserva aree sospette di IM nell'antro e/o nel corpo che si trovano all'interno delle posizioni del Sistema Sydney aggiornato sopra definite, devono essere prelevate biopsie per l'esame istologico, nonché 2 biopsie congelate adiacenti, da queste aree sospette di IM Invece.

Se l'endoscopista osserva aree sospette di IM nell'antro e/o nel corpo che si trovano al di fuori delle posizioni del Sistema Sydney aggiornato sopra definite, le 2 biopsie congelate adiacenti devono invece essere prelevate da queste aree sospette di IM.

Tutte le lesioni della mucosa identificate durante l'OGD saranno sottoposte a biopsia separatamente come parte della normale pratica clinica e inviate per la valutazione istopatologica.

I campioni bioptici congelati saranno conservati in una banca dei tessuti di alta qualità.

Gli investigatori seguiranno il protocollo di cui sopra. Tuttavia, possono discostarsi dal protocollo se gli interessi del paziente lo richiedono.

Raccolta, elaborazione e analisi del sangue:

Da ogni soggetto verranno prelevati 20 ml di sangue. Saranno estratti siero, plasma e buffy coat.

Valutazione istologica:

Tutti i campioni bioptici saranno valutati per grado di gastrite cronica, gastrite atrofica, presenza di organismi H. pylori, IM e displasia. Questi verranno valutati utilizzando il sistema Sydney aggiornato. La presenza di IM è indicata dalla presenza di cellule globose basate sulla colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) o dall'espressione positiva di Alcian Blue (AB) e sarà classificata in lieve, moderata e marcata. La displasia sarà classificata dalla classificazione di Vienna rivista e la classificazione del carcinoma sarà conforme alla classificazione dei tumori dell'OMS e al sistema di stadiazione AJCC. La percentuale di mucosa epiteliale gastrica che mostra le caratteristiche di IM nelle biopsie sarà valutata per derivare lo stadio OLGIM.

Prova molecolare:

Tre principali alterazioni genomiche - aumento delle frequenze di mutazione, alterazioni del numero di copie somatiche (sCNA) e accorciamento dei telomeri - sono state precedentemente stabilite per mostrare associazioni con la progressione della malattia da IM a displasia o GC o la persistenza di IM. È stato riscontrato che una percentuale significativa di sCNA nei campioni IM si trova nel cromosoma 8q, dove risiede l'oncogene Myc. Verrà sviluppato un test molecolare personalizzato basato su un pannello mirato principalmente alle regioni genomiche con geni mutati in modo ricorrente e amplificazione del cromosoma 8q nei pazienti IM. Il test personalizzato mira a stratificare ulteriormente i pazienti IM. Il DNA genomico totale sarà estratto da biopsie (tessuto congelato e FFPE) e campioni di sangue abbinati. Verrà applicato un pannello genetico mirato in modo da catturare specifiche regioni genomiche di interesse, riducendo significativamente il costo e la quantità di analisi dei dati. La preparazione della libreria verrà eseguita utilizzando i saggi di arricchimento del target secondo le istruzioni del produttore. Le chiamate di mutazione e l'amplificazione del cromosoma 8q saranno determinate utilizzando il software Genome Analysis Toolkit (GATK). I soggetti sono classificati come positivi al test se viene identificata una variante somatica con almeno 10 letture di supporto della variante o una variante del numero di copie con copertura media segmentata di almeno 2 deviazioni standard dalla media neutra della copia.

profilo del miRNA: l'RNA totale dal siero viene isolato e convertito in cDNA, che viene quindi quantificato. I livelli di espressione di miRNA target dopo la normalizzazione delle variazioni sia tecniche che biologiche vengono analizzati per identificare pannelli di miRNA con il più alto potere discriminatorio tra stati sani e malati. Ad ogni soggetto verrà assegnato un punteggio basato sul profilo di espressione del miRNA, che indica la possibilità di avere GC. Il risultato sarà confrontato con OGD e istologia che è il gold standard per la diagnosi di GC.

Seguito:

I soggetti saranno seguiti presso la clinica o via telefono per l'aggiornamento dello stato agli anni 1 e 3. I dati clinici saranno raccolti tramite un questionario. È accettabile un periodo finestra di 6 mesi prima o dopo la data dell'OGD di base dell'anniversario.

I soggetti saranno sottoposti a un OGD di sorveglianza agli anni 2 e 4 per valutare se il soggetto ha raggiunto l'endpoint. Le biopsie verranno prelevate seguendo il protocollo descritto. I dati clinici saranno raccolti attraverso un questionario e il database aggiornato. È accettabile un periodo finestra di 6 mesi prima o dopo la data dell'OGD di base dell'anniversario.

I soggetti saranno seguiti annualmente presso la clinica o via telefono per l'aggiornamento dello stato per gli anni 5-10. I dati clinici saranno raccolti attraverso un questionario. È accettabile un periodo finestra di 6 mesi prima o dopo la data dell'OGD di base dell'anniversario. Se l'incidenza di GC all'anno 4 o dopo nella coorte è sufficiente a rifiutare l'ipotesi nulla con il livello di significatività e potenza descritti, il follow-up annuale per gli anni 5-10 può essere interrotto.

Calcolo della dimensione del campione:

La dimensione del campione proposta per lo studio prospettico di coorte è stata stimata utilizzando il logrank test per l'esito del tempo alla progressione. Supponendo un'incidenza cumulativa di 4 anni di progressione rispettivamente del 10% nel gruppo del test positivo e del 3% nel gruppo del test negativo (cioè hazard ratio, HR = 3,5), sarà richiesta una dimensione del campione di 480 basata su un livello di significatività del 5% e una potenza dell'85%. Supponendo inoltre un attrito del 5%, la dimensione complessiva del campione sarà di 500.

Analisi statistica:

Le variabili categoriali saranno analizzate utilizzando il test chi-quadro o il test esatto di Fisher. Le variabili continue saranno analizzate utilizzando il test t di Student o il test U di Mann-Whitney. I parametri con valore P <0,05 nell'analisi univariata saranno inclusi nell'analisi multivariata. L'analisi multivariata sarà eseguita utilizzando l'analisi di regressione di Cox. P <0,05 è considerato statisticamente significativo.