Molekyylitestin validointi korkean riskin suoliston metaplasiaa sairastavien potilaiden riskien jakautumiseksi (GCEP2-tutkimus)

Tavoitteet:

Tämän tutkimuksen päätavoitteena on määrittää, voidaanko mukautetulla molekyylitestillä tunnistaa prospektiivisesti potilaiden, joilla on suoliston metaplasiaa (IM) joukossa potilaiden alaryhmä, jolla on erittäin korkea dysplasia- tai mahasyövän (GC) riski. Tämän tutkimuksen toissijaisina tavoitteina on validoida veren mikroRNA-biomarkkereiden paneelin ennustearvo GC-riskin ennustamiseksi, sekä määrittää helikobakteeri-infektion havaitsemisen tarkkuus seuraavan sukupolven sekvensoinnilla ja verrata sitä nykyiseen. kultastandardi, urean hengitystesti.

Opintojen suunnittelu:

Kansainvälinen, monikeskuskohortti arvioimaan räätälöidyn molekyylitestin kliinistä käyttökelpoisuutta sellaisten IM-potilaiden osajoukon tunnistamiseksi, joilla on erittäin korkea GC-riski. Tavoitteena on rekrytoida 500 henkilöä, joilla on OLGIM-vaiheen 2–4 IM.

Koska päivitettyä Sydneyn biopsiaprotokollaa ei suoriteta rutiininomaisesti kliinisiin tarkoituksiin ja useimmat koehenkilöt rekrytoidaan ennen OLGIM-vaiheen vahvistamista lähtötilanteessa, jotkin koehenkilöt poistetaan tutkimuksesta, jos heillä ei havaita IM:tä tai IM:n arvioitu olevan OLGIM-vaihe 1, lähtötilanteessa OGD.

Yhteistyöpisteitä pyydetään toimittamaan seuraavat näytteet ja niihin liittyvät demografiset ja kliinis-patologiset tiedot (kuten tapausraporttilomakkeessa on ilmoitettu): Snap-jäädytetty kudos ja FFPE-kudos antrumin kohdasta DNA-uuttoa varten, seerumi H. pylori -vasta-ainetestiä ja miRNA-profilointia varten. ja buffy coat DNA:n uuttamiseen.

Ilmoittautuminen:

Potilaat, jotka tutkijat ovat ottaneet vastaan ​​klinikan aikana, otetaan huomioon.

Jotta minimoidaan niiden tutkimushenkilöiden lukumäärä, jotka lopetetaan lähtötilanteen endoskopian jälkeen, koska vähintään vaiheen 2–4 OLGIM ei havaittu lähtötilanteessa, potilaat, joilla on aiemmin ollut kohtalainen tai vaikea IM joko antrumissa tai kehossa, voidaan priorisoida rekrytointiin.

Perustaso:

1. Kyselylomake Tutkittavia pyydetään täyttämään peruskyselylomake, joka antaa tietoja GC:n demografisista tiedoista, henkilökohtaisesta sairaushistoriasta, elämäntavoista ja sukuhistoriasta. Kliiniset tiedot ja tunnisteet tallennetaan.
2. Urea-hengitystesti Koehenkilöt paastoavat 6 tuntia tai yön yli ennen ureahengitystestiä (UBT). Hengityskeräys suoritetaan ennen 13C-urean nauttimista ja 10 minuuttia, 20 minuuttia ja 30 minuuttia nauttimisen jälkeen.
3. OGD ja biopsiat

Koehenkilöt läpikäyvät perustilanteen OGD:n teräväpiirtovalossa (1080p) ja biopsian OLGIM-tilan varmistamiseksi. Diagnoosin vahvistamismenettelyn aikana OGD:stä tehdään videotallenne. Mahalaukun limakalvon biopsiat otetaan seuraavasti:

• 1 biopsia AL:sta, AG:sta, IA:sta, BL:stä ja BG:stä kutakin päivitetyn Sydney Systemin mukaan kiinnitetään 4 % paraformaldehydissä (PFA) ja lähetetään histologiseen tutkimukseen
• 2 vierekkäistä biopsiaa AL:ssa ja 2 vierekkäistä biopsiaa BL:ssä pikapakastetaan nestetypessä

Paikat on määritelty seuraavasti:

• AL - antrumin pienempi kaarevuus, 2-3 cm pyloruksesta
• AG - antrumin suurempi kaarevuus, 2-3 cm pyloruksesta
• IA - incisura angularis
• BL - corpuksen pienempi kaarevuus, 4 cm proksimaalisesti kulmakivestä
• BG - rungon suuremman kaarevuuden keskiosa, 8 cm sydämestä

Jos endoskooppi havaitsee IM:n epäiltyjä alueita antrumissa ja/tai kehossa, jotka ovat yllä määritellyissä päivitetyn Sydney-järjestelmän sijainneissa, näiltä IM:n epäillyiltä alueilta tulee ottaa biopsiat histologista tutkimusta varten sekä 2 vierekkäistä jäädytettyä biopsiaa. sen sijaan.

Jos endoskooppilääkäri havaitsee IM:n epäiltyjä alueita antrumissa ja/tai kehossa, jotka ovat yllä määriteltyjen päivitetyn Sydney-järjestelmän sijaintien ulkopuolella, 2 vierekkäistä jäädytettyä biopsiaa tulee sen sijaan ottaa näiltä IM:n epäillyiltä alueilta.

Kaikista OGD:n aikana tunnistetuista limakalvovaurioista otetaan biopsia erikseen osana normaalia kliinistä käytäntöä ja lähetetään histopatologiseen arviointiin.

Pakastetut biopsianäytteet säilytetään korkealaatuisessa kudospankissa.

Tutkijat noudattavat yllä olevaa protokollaa. He voivat kuitenkin poiketa protokollasta, jos potilaan edut sitä edellyttävät.

Verenotto, käsittely ja analyysit:

Jokaisesta koehenkilöstä otetaan 20 ml verta. Seerumi, plasma ja buffy coat uutetaan.

Histologinen arvio:

Kaikista biopsianäytteistä arvioidaan kroonisen gastriitin, atrofisen gastriitin, H. pylori -organismien, IM:n ja dysplasian esiintyminen. Nämä pisteytetään päivitetyn Sydney-järjestelmän avulla. IM:n esiintyminen osoittaa globet-solujen läsnäolon, joka perustuu hematoksyliini- ja eosiinivärjäykseen (H&E) tai Alcian Blue (AB) -positiiviseen ekspressioon, ja se luokitellaan lievään, kohtalaiseen ja merkittävään. Dysplasia luokitellaan tarkistetun Wienin luokituksen mukaan, ja karsinooman luokitus on WHO:n kasvainten luokituksen ja AJCC-vaihejärjestelmän mukaan. Mahalaukun epiteelin limakalvon prosenttiosuus, joka osoittaa IM:n piirteitä biopsioissa, arvioidaan OLGIM-vaiheen johtamiseksi.

Molekyylitesti:

Kolme pääasiallista genomista muutosta - lisääntyneet mutaatiotaajuudet, somaattisten kopiolukujen muutokset (sCNA:t) ja telomeerien lyheneminen - havaittiin aiemmin osoittamaan yhteyksiä IM:n taudin etenemiseen dysplasiaksi tai GC:ksi tai IM:n pysyvyyteen. Huomattavan osan sCNA:ista IM-näytteissä havaittiin sijaitsevan kromosomissa 8q, missä on onkogeeni Myc. Räätälöity molekyylitesti kehitetään paneelin pohjalta, joka kohdistuu ensisijaisesti genomialueisiin, joissa on toistuvasti mutatoituneita geenejä ja kromosomi 8q:n monistumista IM-potilailla. Räätälöidyn testin tarkoituksena on jakaa IM-potilaita edelleen. Koko genominen DNA uutetaan biopsioista (jäädytetty kudos ja FFPE) ja yhteensovitetuista verinäytteistä. Kohdennettua geenipaneelia käytetään siten, että tietyt kiinnostavat genomialueet vangitaan, mikä vähentää merkittävästi data-analyysin kustannuksia ja määrää. Kirjaston valmistelu suoritetaan käyttämällä kohderikastusmäärityksiä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mutaatiokutsut ja kromosomin 8q:n vahvistus määritetään Genome Analysis Toolkit (GATK) -ohjelmistolla. Koehenkilöt luokitellaan testipositiivisiksi, jos tunnistetaan somaattinen variantti, jossa on vähintään 10 muunnelmaa, jotka tukevat lukemia, tai kopiolukuvariantti, jonka segmentoitu keskihajonna on vähintään 2 standardipoikkeamaa poispäin kopioneutraalista keskiarvosta.

miRNA-profilointi: Seerumin kokonais-RNA eristetään ja muunnetaan cDNA:ksi, joka sitten kvantifioidaan. MiRNA:n kohdeekspressiotasot analysoidaan sekä teknisten että biologisten muunnelmien normalisoinnin jälkeen sellaisten miRNA-paneelien tunnistamiseksi, joilla on suurin erotuskyky terveiden ja sairaustilojen välillä. Jokaiselle koehenkilölle annetaan pistemäärä miRNA-ekspressioprofiilin perusteella, mikä osoittaa mahdollisuutta saada GC. Tulosta verrataan OGD:hen ja histologiaan, joka on kultainen standardi GC:n diagnosoinnissa.

Seuranta:

Koehenkilöitä seurataan klinikalla tai puhelimitse tilapäivitystä varten vuosilla 1 ja 3. Kliiniset tiedot kerätään kyselylomakkeella. Kuuden kuukauden ikkunajakso ennen vuosipäivää tai sen jälkeen on hyväksyttävä.

Koehenkilöt käyvät läpi seuranta-OGD:n vuosina 2 ja 4 sen arvioimiseksi, onko tutkimushenkilö saavuttanut päätepisteen. Biopsiat otetaan kuvattua protokollaa noudattaen. Kliiniset tiedot kerätään kyselylomakkeella ja tietokanta päivitetään. Kuuden kuukauden ikkunajakso ennen vuosipäivää tai sen jälkeen on hyväksyttävä.

Koehenkilöitä seurataan vuosittain klinikalla tai puhelimitse tilapäivitystä varten vuosille 5-10. Kliiniset tiedot kerätään kyselylomakkeella. Kuuden kuukauden ikkunajakso ennen vuosipäivää tai sen jälkeen on hyväksyttävä. Jos GC:n esiintyvyys vuonna 4 tai sen jälkeen kohortissa riittää hylkäämään nollahypoteesi kuvatulla merkitystasolla ja voimakkuudella, vuosittainen seuranta vuosille 5-10 voidaan keskeyttää.

Näytteen kokolaskenta:

Prospektiivisen kohorttitutkimuksen ehdotettu otoskoko arvioitiin logrank-testillä, joka määritettiin etenemiseen kuluvaan tulokseen. Olettaen, että 4 vuoden kumulatiivinen etenemisen ilmaantuvuus on 10 % testipositiivisessa ryhmässä ja 3 % negatiivisessa ryhmässä (ts. vaarasuhde, HR = 3,5), vaaditaan 480 otos, joka perustuu 5 %:n merkitsevyystasoon ja 85 %:n tehoon. Edelleen olettaen, että hankaus on 5 %, kokonaisotoskoko on 500.

Tilastollinen analyysi:

Kategoriset muuttujat analysoidaan khin neliötestillä tai Fisherin eksaktilla testillä. Jatkuvat muuttujat analysoidaan Studentin t-testillä tai Mann-Whitney U -testillä. Parametrit, joiden P-arvo <0,05 yksimuuttujaanalyysissä, sisällytetään monimuuttujaanalyysiin. Monimuuttujaanalyysi suoritetaan käyttämällä Cox-regressioanalyysiä. P <0,05 katsotaan tilastollisesti merkitseväksi.