Validación de una prueba molecular para la estratificación de riesgo de pacientes con metaplasia intestinal de alto riesgo (estudio GCEP2)

Objetivos:

El principal objetivo de este estudio es determinar si un test molecular personalizado puede identificar prospectivamente, dentro de los pacientes con metaplasia intestinal (MI), un subgrupo de pacientes con muy alto riesgo de displasia o cáncer gástrico (CG). Los objetivos secundarios de este estudio son validar el valor predictivo de un panel de biomarcadores de microARN en sangre para predecir el riesgo de CG, así como determinar la precisión de la detección de la infección por Helicobacter pylori mediante secuenciación de última generación y compararla con la actual. estándar de oro, prueba de aliento con urea.

Diseño del estudio:

Una cohorte internacional multicéntrica para evaluar la utilidad clínica de una prueba molecular personalizada para identificar un subconjunto de pacientes con MI con un riesgo muy alto de CG. El reclutamiento objetivo es de 500 sujetos con IM de OLGIM Etapa 2 a 4.

Dado que el protocolo de biopsia de Sydney actualizado no se realiza de forma rutinaria con fines clínicos y la mayoría de los sujetos se reclutarán antes de confirmar su estadificación OLGIM al inicio del estudio, algunos sujetos se retirarán del estudio si se detecta que no tienen IM o si se evalúa que IM es Etapa 1 de OLGIM, en la OGD inicial.

Se solicita a los sitios colaboradores que proporcionen las siguientes muestras con datos demográficos y clínico-patológicos asociados (como se indica en el Formulario de informe de caso): Tejido ultracongelado y tejido FFPE del sitio del antro para extracción de ADN, suero para prueba de anticuerpos contra H. pylori y perfil de miARN y capa leucocítica para la extracción de ADN.

Inscripción:

Los pacientes vistos por los investigadores durante las clínicas serán considerados para la inscripción.

Para minimizar el número de sujetos que se retiran después de la endoscopia inicial debido a que no se detectó al menos OLGIM en estadio 2-4 al inicio, se puede priorizar el reclutamiento de pacientes con antecedentes de MI moderada o grave en el antro o el cuerpo.

Base:

1. Cuestionario Se pedirá a los sujetos que completen un cuestionario de referencia, proporcionando información sobre la demografía, el historial médico personal, el estilo de vida y los antecedentes familiares de GC. Se registrarán datos clínicos e identificadores.
2. Prueba de aliento con urea Los sujetos ayunarán durante 6 horas o toda la noche antes de someterse a la prueba de aliento con urea (UBT). La recolección de aliento se realizará antes de la ingestión de urea 13C, ya los 10 min, 20 min y 30 min después de la ingestión.
3. OGD y biopsias

Los sujetos se someterán a una OGD de referencia con luz blanca de alta definición (1080p) y una biopsia para determinar el estado de OLGIM. Durante el procedimiento de validación del diagnóstico se realizará una videograbación de la DAG. Las biopsias de la mucosa gástrica se tomarán de la siguiente manera:

• Se fijará 1 biopsia de AL, AG, IA, BL, BG según el Sistema Sydney actualizado en paraformaldehído (PFA) al 4 % y se enviará para examen histológico
• 2 biopsias adyacentes en AL y 2 biopsias adyacentes en BL se congelarán instantáneamente en nitrógeno líquido

Las ubicaciones se definen de la siguiente manera:

• AL - curvatura menor del antro, dentro de 2-3 cm del píloro
• AG - curvatura mayor del antro, dentro de 2-3 cm del píloro
• IA - incisura angularis
• BL - curvatura menor del cuerpo, 4 cm proximal al ángulo
• BG - porción media de la curvatura mayor del cuerpo, a 8 cm del cardias

Si el endoscopista observa áreas sospechosas de MI en el antro y/o el cuerpo que se encuentran dentro de las ubicaciones del Sistema Sydney actualizado definidas anteriormente, entonces se deben tomar biopsias para el examen histológico, así como 2 biopsias congeladas adyacentes, de estas áreas sospechosas de MI. en cambio.

Si el endoscopista observa áreas sospechosas de MI en el antro y/o el cuerpo que están fuera de las ubicaciones del Sistema Sydney actualizado definidas anteriormente, entonces las 2 biopsias congeladas adyacentes deben tomarse de estas áreas sospechosas de MI.

Todas las lesiones de la mucosa identificadas durante la OGD se someterán a una biopsia por separado como parte de la práctica clínica normal y se enviarán para una evaluación histopatológica.

Las muestras de biopsias congeladas se almacenarán en un banco de tejidos de alta calidad.

Los investigadores seguirán el protocolo anterior. Sin embargo, pueden desviarse del protocolo si los intereses del paciente así lo exigen.

Recolección de sangre, procesamiento y análisis:

Se extraerán 20 ml de sangre de cada sujeto. Se extraerán suero, plasma y capa leucocítica.

Evaluación histológica:

Todas las muestras de biopsia se evaluarán para determinar el grado de gastritis crónica, gastritis atrófica, presencia de organismos H. pylori, MI y displasia. Estos se calificarán utilizando el Sistema Sydney actualizado. La presencia de MI está indicada por la presencia de células del globo terráqueo según la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) o la expresión positiva de azul alcián (AB), y se clasificará en leve, moderada y marcada. La displasia se clasificará según la clasificación de Viena revisada, y la clasificación del carcinoma se realizará de acuerdo con la clasificación de tumores de la OMS y el sistema de estadificación del AJCC. El porcentaje de mucosa epitelial gástrica que muestra las características de IM en las biopsias se evaluará para derivar el estadio OLGIM.

Prueba molecular:

Tres alteraciones genómicas principales (aumento de las frecuencias de mutación, alteraciones del número de copias somáticas (sCNA) y acortamiento de los telómeros) se establecieron previamente para mostrar asociaciones con la progresión de la enfermedad de IM a displasia o GC, o persistencia de IM. Se encontró que una proporción significativa de sCNA en muestras IM estaba ubicada en el cromosoma 8q, donde reside el oncogén Myc. Se desarrollará una prueba molecular personalizada basada en un panel dirigido principalmente a regiones genómicas con genes mutados recurrentemente y amplificación del cromosoma 8q en pacientes con MI. La prueba personalizada tiene como objetivo estratificar aún más a los pacientes con MI. El ADN genómico total se extraerá de biopsias (tejido congelado y FFPE) y muestras de sangre compatibles. Se aplicará un panel de genes específicos para capturar regiones genómicas específicas de interés, reduciendo significativamente el costo y la cantidad de análisis de datos. La preparación de la biblioteca se realizará utilizando los ensayos de enriquecimiento de destino de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las llamadas de mutación y la amplificación del cromosoma 8q se determinarán utilizando el software Genome Analysis Toolkit (GATK). Los sujetos se clasifican como positivos en la prueba si se identifica una variante somática con al menos 10 lecturas de apoyo variantes o una variante del número de copias con una cobertura media segmentada de al menos 2 desviaciones estándar de la media neutral de copias.

Perfilado de miARN: el ARN total del suero se aísla y se convierte en ADNc, que luego se cuantifica. Los niveles de expresión de miARN objetivo después de la normalización de las variaciones técnicas y biológicas se analizan para identificar paneles de miARN con el poder discriminatorio más alto entre estados sanos y enfermos. A cada sujeto se le asignará una puntuación basada en el perfil de expresión de miRNA, indicando la posibilidad de tener GC. El resultado se comparará con OGD e histología, que es el estándar de oro para el diagnóstico de GC.

Hacer un seguimiento:

Se realizará un seguimiento de los sujetos en la clínica o por teléfono para actualizar el estado en los años 1 y 3. Los datos clínicos se recopilarán a través de un cuestionario. Se acepta un período de ventana de 6 meses antes o después de la fecha de OGD de referencia del aniversario.

Los sujetos se someterán a un OGD de vigilancia en los años 2 y 4 para evaluar si el sujeto ha alcanzado el punto final. Se tomarán biopsias siguiendo el protocolo descrito. Los datos clínicos se recogerán a través de un cuestionario y la base de datos se actualizará. Se acepta un período de ventana de 6 meses antes o después de la fecha de OGD de referencia del aniversario.

Se hará un seguimiento de los sujetos anualmente en la clínica o por teléfono para actualizar el estado de los años 5 a 10. Los datos clínicos se recogerán a través de un cuestionario. Se acepta un período de ventana de 6 meses antes o después de la fecha de OGD de referencia del aniversario. Si la incidencia de CG en el año 4 o después entre la cohorte es suficiente para rechazar la hipótesis nula con el nivel de significación y potencia descrito, se puede interrumpir el seguimiento anual para los años 5 a 10.

Cálculo del tamaño de la muestra:

El tamaño de muestra propuesto para el estudio de cohorte prospectivo se estimó utilizando la prueba de rango logarítmico para el resultado del tiempo hasta la progresión. Suponiendo una incidencia acumulada de progresión de 4 años del 10 % en el grupo de prueba positiva y del 3 % en el grupo de prueba negativa, respectivamente (es decir, razón de riesgo, HR = 3,5), se requerirá un tamaño de muestra de 480 con base en un nivel de significación del 5 % y una potencia del 85 %. Suponiendo además una deserción del 5 %, el tamaño total de la muestra será de 500.

Análisis estadístico:

Las variables categóricas se analizarán mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. Las variables continuas se analizarán mediante la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney. Los parámetros con valor de p <0,05 en el análisis univariante se incluirán en el análisis multivariante. El análisis multivariado se realizará utilizando el análisis de regresión de Cox. P <0,05 se considera estadísticamente significativo.