Validação de um Teste Molecular para Estratificação de Risco de Pacientes com Metaplasia Intestinal de Alto Risco (Estudo GCEP2)

Objetivos.

O principal objetivo deste estudo é determinar se um teste molecular personalizado pode identificar prospectivamente, dentro de pacientes com metaplasia intestinal (IM), um subgrupo de pacientes com risco muito alto de displasia ou câncer gástrico (CG). Os objetivos secundários deste estudo são validar o valor preditivo de um painel de biomarcadores de microRNA sanguíneo para prever o risco de GC, bem como determinar a precisão da detecção da infecção por Helicobacter pylori usando sequenciamento de próxima geração e compará-lo com o atual padrão-ouro, teste respiratório da ureia.

Design de estudo:

Uma coorte multicêntrica internacional para avaliar a utilidade clínica de um teste molecular personalizado para identificar um subconjunto de pacientes com IM com risco muito alto de GC. O recrutamento alvo é de 500 indivíduos com IM de OLGIM Estágio 2 a 4.

Como o protocolo de biópsia de Sydney atualizado não é realizado rotineiramente para fins clínicos e a maioria dos indivíduos será recrutada antes de confirmar seu estadiamento OLGIM na linha de base, alguns indivíduos serão retirados do estudo se forem detectados como não tendo IM, ou IM avaliados para serem OLGIM Estágio 1, na linha de base OGD.

Os locais colaboradores são solicitados a fornecer as seguintes amostras com dados demográficos e clínico-patológicos associados (conforme indicado no Formulário de Relato de Caso): Tecido congelado e tecido FFPE do local do antro para extração de DNA, soro para teste de anticorpo H. pylori e perfil de miRNA , e buffy coat para extração de DNA.

Inscrição:

Os pacientes vistos pelos investigadores durante as clínicas serão considerados para inscrição.

Para minimizar o número de indivíduos que são retirados após a endoscopia basal devido à falha em detectar pelo menos Estágio 2-4 OLGIM na linha basal, pacientes com história de IM moderada ou grave no antro ou no corpo podem ser priorizados para recrutamento.

Linha de base:

1. Questionário Os participantes serão solicitados a preencher um questionário básico, fornecendo informações sobre dados demográficos, histórico médico pessoal, estilo de vida e histórico familiar de GC. Dados clínicos e identificadores serão registrados.
2. Os participantes do Teste de Respiração de Ureia jejuarão por 6 horas ou durante a noite antes de serem submetidos ao Teste de Respiração de Uréia (UBT). A coleta da respiração será realizada antes da ingestão da ureia 13C, e aos 10min, 20min e 30min após a ingestão.
3. OGD e biópsias

Os indivíduos serão submetidos a um OGD basal sob luz branca de alta definição (1080p) e biópsia para verificar o status OLGIM. Durante o procedimento será realizada uma videogravação do OGD para validação do diagnóstico. As biópsias da mucosa gástrica serão realizadas da seguinte forma:

• 1 biópsia cada de AL, AG, IA, BL, BG de acordo com o Sistema Atualizado de Sydney será fixada em 4% de paraformaldeído (PFA) e enviada para exame histológico
• 2 biópsias adjacentes em AL e 2 biópsias adjacentes em BL serão congeladas em nitrogênio líquido

Os locais são definidos da seguinte forma:

• AL - curvatura menor do antro, dentro de 2-3cm do piloro
• AG - curvatura maior do antro, dentro de 2-3cm do piloro
• IA - incisura angularis
• BL - curvatura menor do corpo, 4cm proximal ao ângulo
• BG - porção média da curvatura maior do corpo, a 8cm da cárdia

Caso o endoscopista observe áreas suspeitas de IM no antro e/ou corpo que estejam dentro dos locais do Sistema de Sydney atualizados acima definidos, biópsias para exame histológico, bem como 2 biópsias congeladas adjacentes, devem ser feitas dessas áreas suspeitas de IM em vez de.

Caso o endoscopista observe áreas suspeitas de IM no antro e/ou corpo que estejam fora dos locais do Sistema de Sydney atualizado acima definidos, as 2 biópsias congeladas adjacentes devem ser feitas dessas áreas suspeitas de IM.

Todas as lesões mucosas identificadas durante o OGD serão biopsiadas separadamente como parte da prática clínica normal e enviadas para avaliação histopatológica.

As amostras de biópsia congeladas serão armazenadas em um banco de tecidos de alta qualidade.

Os investigadores seguirão o protocolo acima. No entanto, eles podem se desviar do protocolo se os interesses do paciente assim o exigirem.

Coleta, processamento e análises de sangue:

Serão colhidos 20mls de sangue de cada indivíduo. Soro, plasma e buffy coat serão extraídos.

Avaliação Histológica:

Todas as amostras de biópsia serão avaliadas quanto ao grau de gastrite crônica, gastrite atrófica, presença de organismos H. pylori, IM e displasia. Estes serão pontuados usando o Sistema Atualizado de Sydney. A presença de IM é indicada pela presença de células globulares com base na coloração de hematoxilina e eosina (H&E) ou expressão positiva de Alcian Blue (AB), e será classificada em leve, moderada e acentuada. A displasia será graduada pela classificação revisada de Viena, e a classificação do carcinoma será de acordo com a classificação de tumores da OMS e o sistema de estadiamento AJCC. A porcentagem de mucosa epitelial gástrica mostrando as características de IM em biópsias será avaliada para derivar o estágio OLGIM.

Teste molecular:

Três principais alterações genômicas - aumento das frequências de mutação, alterações no número de cópias somáticas (sCNAs) e encurtamento dos telômeros - foram previamente estabelecidas para mostrar associações com a progressão da doença de MI para displasia ou GC, ou persistência de MI. Uma proporção significativa de sCNAs em amostras IM foi encontrada no cromossomo 8q, onde reside o oncogene Myc. Um teste molecular personalizado será desenvolvido com base em um painel direcionado principalmente para regiões genômicas com genes mutados recorrentemente e amplificação do cromossomo 8q em pacientes com MI. O teste personalizado visa estratificar ainda mais os pacientes com IM. O DNA genômico total será extraído de biópsias (tecido congelado e FFPE) e amostras de sangue pareadas. Um painel de genes direcionados será aplicado para que regiões genômicas específicas de interesse sejam capturadas, reduzindo significativamente o custo e a quantidade de análise de dados. A preparação da biblioteca será realizada usando os ensaios de enriquecimento alvo de acordo com as instruções do fabricante. Chamadas de mutação e amplificação do cromossomo 8q serão determinadas usando o software Genome Analysis Toolkit (GATK). Os indivíduos são classificados como positivos para o teste se for identificada uma variante somática com pelo menos 10 leituras variantes de suporte ou uma variante de número de cópias com cobertura média segmentada de pelo menos 2 desvios padrão da média neutra de cópia.

Perfil de miRNA: O RNA total do soro é isolado e convertido em cDNA, que é então quantificado. Os níveis de expressão de miRNA alvo após a normalização das variações técnicas e biológicas são analisados ​​para identificar painéis de miRNAs com o maior poder discriminatório entre estados saudáveis ​​e doentes. Cada indivíduo receberá uma pontuação com base no perfil de expressão do miRNA, indicando a possibilidade de ter GC. O resultado será comparado com OGD e histologia que é o padrão ouro para o diagnóstico de GC.

Seguir:

Os indivíduos serão acompanhados na clínica ou por telefone para atualização de status nos Anos 1 e 3. Os dados clínicos serão coletados por meio de um questionário. É aceitável um período de janela de 6 meses antes ou depois da data base de aniversário OGD.

Os indivíduos serão submetidos a um OGD de vigilância nos anos 2 e 4 para avaliar se o indivíduo atingiu o ponto final. As biópsias serão feitas seguindo o protocolo descrito. Os dados clínicos serão coletados por meio de um questionário e o banco de dados atualizado. É aceitável um período de janela de 6 meses antes ou depois da data base de aniversário OGD.

Os indivíduos serão acompanhados anualmente na clínica ou por telefone para atualização de status para os anos 5-10. Os dados clínicos serão coletados por meio de um questionário. É aceitável um período de janela de 6 meses antes ou depois da data base de aniversário OGD. Caso a incidência de GC no ano 4 ou após no coorte seja suficiente para rejeitar a hipótese nula com o nível de significância e poder conforme descrito, o acompanhamento anual para os anos 5-10 pode ser descontinuado.

Cálculo do tamanho da amostra:

O tamanho da amostra proposto para o estudo de coorte prospectivo foi estimado usando o teste logrank para o resultado do tempo de progressão. Assumindo uma incidência cumulativa de 4 anos de progressão de 10% no grupo de teste positivo e 3% no grupo de teste negativo, respectivamente (ou seja, taxa de risco, HR = 3,5), será necessário um tamanho de amostra de 480 com base em um nível de significância de 5% e um poder de 85%. Supondo ainda um atrito de 5%, o tamanho total da amostra será de 500.

Análise estatística:

As variáveis ​​categóricas serão analisadas por meio do teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Variáveis ​​contínuas serão analisadas pelo teste t de Student ou teste U de Mann-Whitney. Parâmetros com valor de P < 0,05 na análise univariada serão incluídos na análise multivariada. A análise multivariada será realizada por meio da análise de regressão de Cox. P <0,05 é considerado estatisticamente significativo.