Mupirosiinin dekolonisaation vaikutus nenän mikrobiomiin

A. Tulostoimenpiteet: Tämä on pohjimmiltaan kuvaava tutkimus. Määrittelemme nenän mikrobiot ennen ja jälkeen dekolonisaatiohoidon mupirosiinilla.

B. Kuvaus rekisteröitävästä populaatiosta: VA-Denverin potilaat, jotka aloittavat nenän mupirosiinihoidon S. aureus -kolonisaatiota varten, otetaan mukaan. Dekolonisaatiohoidon yleisiä indikaatioita ovat valmistautuminen nivelleikkaukseen ja potilaan eristäytymisen helpottaminen pitkäaikaista kuntoutuspalvelua varten. Kirjallinen tietoinen suostumus hankitaan.

C. Tutkimussuunnitelma ja tutkimusmenetelmät: Nenäpuikko otetaan juuri ennen mupirosiinihoidon aloittamista, 48 tunnin kuluessa mupirosiinihoidon päättymisestä, viikon, kahden viikon, neljän viikon, kahdeksan viikon ja 16 viikon kuluttua mupirosiinihoidon päättymisestä. mupirosiinihoidosta. Vanupuikko asetetaan yhteen naaraan ja sitä pyöritetään 3 sekuntia. Toimenpide toistetaan toisessa naarassa. Molemmat päät jäähdytetään välittömästi ja niitä pidetään 2–5 °C:ssa, kunnes ne voidaan laittaa steriileihin mikroputkiin säilytystä varten -80 °C:ssa. Erillinen vanupuikko viedään suun läpi ja hierotaan risojen ja takanielun yli. säilytetään samalla tavalla.

Laaja-alueen PCR ja suuren suorituskyvyn DNA-sekvensointi rRNA-geenien PCR-monistaminen ja sekvensointi noudattaa aiemmin julkaistua protokollamme (13). Lyhyesti sanottuna DNA-lysaateille suoritetaan PCR pan-bakteerin 16S rDNA rDNA-alukkeilla, mikä tuottaa PCR-amplikonikirjastoja, jotka edustavat kaikkia näytteen bakteereja tai sieniä (14). Kolminkertaiset PCR-reaktiot suoritetaan ja amplikonit yhdistetään kullekin näytteelle. Myrkytyskontrollit, joihin on lisätty bakteereja (esim. Bacillus subtilis) genominen DNA analysoidaan PCR-estäjien läsnäolon havaitsemiseksi templaatti-DNA-valmisteissa; vaikka se ei tyypillisesti ole ongelma nenäpyyhkäisyissä, inhiboivat näytteet puhdistetaan etanolisaostuksella ja lähetetään sitten uudelleen PCR:ään. PCR-amplikonikirjastot sekvensoidaan käyttämällä korkean suorituskyvyn Illumina MiSeq -henkilökohtaista sekvensointialustaa. joka on saatavilla Coloradon yliopiston infektiotautiosaston kautta. Tämä alusta voi tuottaa 5-20 x 106 DNA-sekvenssiä yhdessä instrumentissa keskimääräisillä lukupituuksilla ~ 450 nts. Laajan PCR:ssä käytetyt alukkeet sisältävät ainutlaatuisia viivakoodattuja sekvenssejä useiden amplikonikirjastojen sekvensoimiseksi samanaikaisesti yhdessä instrumentissa (15). Rakennamme ja sekvensoimme kirjastoja 100 näytteestä (50 pysyvää MRSA-kantajaa [tapauksia] ja 50 ei-kantajia [kontrollit]) > 50 000 korkealaatuisen sekvensointilukeman syvyyteen näytettä kohti. Alustava tutkimuksemme osoittaa, että tämä kattavuuden syvyys edustaa täydellistä tutkimusta kunkin näytteen nares-mikrobiotosta.

Sekvenssianalyysi Näytteissä olevat mikrobit tunnistetaan Ribosomal Database Projectin (17) Naive Bayesian Classifier Tool -työkalun (16) avulla. Tietojoukkojen yleisen monimutkaisuuden vähentämiseksi samanlaiset rDNA-sekvenssit klusteroidaan operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) klusteroimalla sekvenssejä taksonomisten tehtävien perusteella. Sitten kootaan datamatriisit, jotka taulukoivat kunkin näytteen OTU:n taajuuden. Näytteenoton kattavuus jokaiselle amplikonikirjastolle arvioidaan (18-20) ja lisäsekvenssit seulotaan, jos kattavuus on alle 95 %. Kaikki sekvenssit talletetaan GenBankiin julkista käyttöä varten.

Ehdokasmikro-organismien validointi Mikrobeja, jotka on tunnistettu laaja-alaisella rDNA-analyysillä mahdollisesti vaikuttaviksi S. aureus -kolonisaatioon, arvioidaan edelleen kohdennettujen QPCR-mittausten perusteella. Alustavien tulostemme ja aiemmin julkaistujen tutkimustemme perusteella, jotka viittaavat niiden häiriintymiseen S. aureuksen kasvuun, sekä S. epidermidis (femA) että Corynebacterium spp. (rpoB PCR) luetellaan Q-PCR:llä (taulukko alla). Alukesarjat uusien mikrobiryhmien Q-PCR-määrityksiin suunnitellaan rDNA-operonien (ts. 16S-ITS-23S-geenit) ARB-ohjelmistopaketin kautta (21). Aiemmin tunnistettujen mikrobiryhmien ja/tai lajien tapauksessa PCR-alukesarjat voidaan tunnistaa kirjallisuushaulla.