Impatto della decolonizzazione della mupirocina sul microbioma nasale

A. Misure di risultato: questo è essenzialmente uno studio descrittivo. Definiremo il microbiota nasale prima e dopo la terapia di decolonizzazione con mupirocina.

B. Descrizione della popolazione da arruolare: verranno arruolati pazienti presso VA-Denver che stanno iniziando un ciclo di terapia con mupirocina nasale per la decolonizzazione da S. aureus. Le indicazioni comuni per la terapia di decolonizzazione sono la preparazione all'intervento chirurgico di sostituzione dell'articolazione e per facilitare la rimozione del paziente dall'isolamento per una permanenza prolungata nel servizio di riabilitazione. Sarà ottenuto il consenso informato scritto.

C. Disegno dello studio e metodi di ricerca: un tampone nasale sarà ottenuto appena prima dell'inizio della terapia con mupirocina, entro 48 ore dal completamento della terapia con mupirocina, una settimana, due settimane, quattro settimane, otto settimane e 16 settimane dopo il completamento della terapia con mupirocina. Il tampone verrà inserito in una narice e ruotato per 3 secondi. La procedura verrà ripetuta sull'altra narice. Le due teste verranno immediatamente refrigerate e mantenute a 2-5° C fino a quando non potranno essere poste in microprovette sterili per la conservazione a -80° C. Un tampone separato verrà passato attraverso la bocca e strofinato sulle tonsille e sull'orofaringe posteriore, e memorizzato nello stesso modo.

PCR ad ampio raggio e sequenziamento del DNA ad alto rendimento L'amplificazione PCR e il sequenziamento dei geni rRNA seguiranno il nostro protocollo precedentemente pubblicato (13). In breve, i lisati di DNA sono sottoposti a PCR con primer pan-batterici 16S rDNA rDNA, che producono librerie di ampliconi PCR rappresentativi di tutti i batteri o funghi in un campione (14). Saranno eseguite reazioni di PCR in triplicato e gli ampliconi saranno raggruppati per ciascun campione. Controlli di avvelenamento addizionati di batteri (ad es. Bacillus subtilis) il DNA genomico sarà analizzato per rilevare la presenza di inibitori della PCR nelle preparazioni di DNA templato; sebbene in genere non sia un problema con i tamponi nasali, i campioni inibitori saranno purificati mediante precipitazione con etanolo e quindi sottoposti nuovamente a PCR. Le librerie di ampliconi PCR saranno sequenziate utilizzando la piattaforma di sequenziamento personale Illumina MiSeq ad alto rendimento. che è disponibile attraverso la Divisione delle malattie infettive dell'Università del Colorado. Questa piattaforma può generare sequenze di DNA 5-20x106 in un singolo strumento eseguito con lunghezze di lettura medie ~ 450 nts. I primer utilizzati per la PCR ad ampio raggio includono sequenze con codice a barre univoche per sequenziare simultaneamente più librerie di ampliconi in un singolo ciclo di strumenti (15). Costruiremo e sequenzeremo librerie da 100 campioni (50 portatori di MRSA persistenti [casi] e 50 non portatori [controlli]) a una profondità di >50.000 letture di sequenziamento di alta qualità per campione. Il nostro studio preliminare indica che questa profondità di copertura rappresenterà un'indagine completa del microbiota delle narici per ciascun esemplare.

Analisi di sequenza I microbi presenti nei campioni saranno identificati attraverso l'uso del Naïve Bayesian Classifier Tool (16) del Ribosomal Database Project (17). Per ridurre la complessità complessiva dei set di dati, sequenze di rDNA simili saranno raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) raggruppando sequenze basate su assegnazioni tassonomiche. Vengono quindi assemblate matrici di dati che tabulano la frequenza di ciascuna OTU in un campione. Verrà stimata la copertura del campionamento per ciascuna libreria di ampliconi (18-20) e verranno esaminate ulteriori sequenze se la copertura è inferiore al 95%. Tutte le sequenze saranno depositate in GenBank per uso pubblico.

Convalida dei microrganismi candidati I microbi identificati attraverso un'analisi rDNA ad ampio raggio come potenziale impatto sulla colonizzazione di S. aureus saranno ulteriormente valutati sulla base di misurazioni QPCR mirate. Sulla base dei nostri risultati preliminari e degli studi precedentemente pubblicati che suggeriscono la loro interferenza con la crescita di S. aureus, sia S. epidermidis, (femA) che Corynebacterium spp., (rpoB PCR) saranno enumerati mediante Q-PCR (tabella sotto). Saranno progettati set di primer per saggi Q-PCR di nuovi gruppi microbici per il rilevamento di operoni rDNA (ad es. geni 16S-ITS-23S) attraverso il pacchetto software ARB (21). Nel caso di gruppi e/o specie microbiche precedentemente riconosciuti, i set di primer PCR possono essere identificati mediante ricerca bibliografica.