Wpływ dekolonizacji mupirocyny na mikrobiom nosa

A. Miary wyników: Jest to zasadniczo badanie opisowe. Określimy mikrobiotę nosa przed i po terapii dekolonizacyjnej mupirocyną.

B. Opis populacji do włączenia: Pacjenci w VA-Denver, którzy rozpoczynają kurs donosowej terapii mupirocyną w celu dekolonizacji S. aureus, zostaną włączeni. Częstymi wskazaniami do terapii dekolonizacyjnej są przygotowanie do zabiegu wymiany stawu oraz ułatwienie wyjęcia pacjenta z izolacji na dłuższy pobyt na oddziale rehabilitacyjnym. Zostanie uzyskana pisemna świadoma zgoda.

C. Projekt badania i metody badawcze: Wymaz z nosa zostanie pobrany tuż przed rozpoczęciem terapii mupirocyną, w ciągu 48 godzin od zakończenia terapii mupirocyną, tydzień, dwa tygodnie, cztery tygodnie, osiem tygodni i 16 tygodni po zakończeniu terapii mupirocyną. Wacik zostanie włożony do jednego nozdrza i obracany przez 3 sekundy. Procedura zostanie powtórzona na drugim nosie. Obie głowy zostaną natychmiast schłodzone i utrzymane w temperaturze 2-5oC do czasu umieszczenia ich w sterylnych mikroprobówkach do przechowywania w temperaturze -80oC. Osobny wymaz zostanie przeprowadzony przez usta i przetarty przez migdałki oraz tylną część jamy ustnej i gardła. przechowywane w ten sam sposób.

Broad-Range PCR i wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie genów rRNA będą zgodne z naszym wcześniej opublikowanym protokołem (13). W skrócie, lizaty DNA poddaje się PCR z panbakteryjnymi starterami 16S rDNA rDNA, co daje biblioteki amplikonów PCR reprezentatywnych dla wszystkich bakterii lub grzybów w próbce (14). Zostaną przeprowadzone potrójne reakcje PCR i połączone amplikony dla każdej próbki. Kontrole zatrucia wzbogacone bakteriami (np. Bacillus subtilis) genomowy DNA zostanie przebadany w celu wykrycia obecności inhibitorów PCR w matrycowych preparatach DNA; chociaż zazwyczaj nie jest to problem z wymazami z nosa, próbki hamujące zostaną oczyszczone przez wytrącanie etanolem, a następnie ponownie przesłane do PCR. Biblioteki amplikonów PCR będą sekwencjonowane przy użyciu wysokowydajnej platformy osobistego sekwencjonowania Illumina MiSeq. który jest dostępny za pośrednictwem Wydziału Chorób Zakaźnych Uniwersytetu Kolorado. Platforma ta może generować sekwencje DNA 5-20x106 w pojedynczym przebiegu instrumentu ze średnią długością odczytu ~450 nt. Startery stosowane w szerokozakresowym PCR obejmują unikalne sekwencje z kodami kreskowymi w celu jednoczesnego sekwencjonowania wielu bibliotek amplikonów w jednym przebiegu aparatu (15). Skonstruujemy i zsekwencjonujemy biblioteki od 100 próbek (50 trwałych nosicieli MRSA [przypadki] i 50 niebędących nosicielami [kontrole]) do głębokości > 50 000 wysokiej jakości odczytów sekwencjonowania na próbkę. Nasze wstępne badanie wskazuje, że ta głębokość pokrycia będzie reprezentować pełne badanie mikroflory nozdrzy dla każdej próbki.

Analiza sekwencji Drobnoustroje obecne w próbkach zostaną zidentyfikowane przy użyciu narzędzia Naïve Bayesian Classifier Tool (16) projektu Ribosomal Database Project (17). Aby zmniejszyć ogólną złożoność zbiorów danych, podobne sekwencje rDNA zostaną zgrupowane w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) poprzez grupowanie sekwencji w oparciu o przypisania taksonomiczne. Następnie składane są macierze danych, które zestawiają częstotliwość każdego OTU w próbce. Pokrycie próbek dla każdej biblioteki amplikonów zostanie oszacowane (18-20) i przeszukane zostaną dodatkowe sekwencje, jeśli pokrycie jest mniejsze niż 95%. Wszystkie sekwencje zostaną zdeponowane w GenBank do użytku publicznego.

Walidacja mikroorganizmów kandydujących Drobnoustroje zidentyfikowane za pomocą szerokozakresowej analizy rDNA jako potencjalnie wpływające na kolonizację S. aureus zostaną poddane dalszej ocenie w oparciu o ukierunkowane pomiary QPCR. Na podstawie naszych wstępnych wyników i wcześniej opublikowanych badań, które sugerują ich interferencję ze wzrostem S. aureus, zarówno S. epidermidis (femA), jak i Corynebacterium spp. (rpoB PCR) zostaną zliczone za pomocą Q-PCR (tabela poniżej). Zestawy starterów do testów Q-PCR nowych grup drobnoustrojów zostaną zaprojektowane do wykrywania operonów rDNA (tj. 16S-ITS-23S) poprzez pakiet oprogramowania ARB (21). W przypadku wcześniej rozpoznanych grup i/lub gatunków drobnoustrojów, zestawy starterów PCR można zidentyfikować poprzez przeszukiwanie literatury.