Virkningen av Mupirocin-dekolonisering på nesemikrobiomet

A. Resultatmål: Dette er i hovedsak en beskrivende studie. Vi vil definere den nasale mikrobiotaen før og etter dekoloniseringsterapi med mupirocin.

B. Beskrivelse av populasjonen som skal meldes inn: Pasienter ved VA-Denver som starter et kurs med nasal mupirocinbehandling for S. aureus-dekolonisering vil bli registrert. De vanlige indikasjonene for dekoloniseringsterapi er forberedelse til leddprotesekirurgi og å legge til rette for å fjerne pasient fra isolasjon for et lengre opphold på rehabiliteringstjenesten. Skriftlig informert samtykke vil bli innhentet.

C. Studiedesign og forskningsmetoder: En nesepinne vil bli tatt rett før oppstart av mupirocinbehandling, innen 48 timer etter fullført mupirocinbehandling, én uke, to uker, fire uker, åtte uker og 16 uker etter fullført av mupirocin-terapi. Pinnen settes inn i en nakke og roteres i 3 sekunder. Prosedyren vil bli gjentatt på den andre nappen. De to hodene vil bli avkjølt umiddelbart, og holdes ved 2-5o C til de kan plasseres i sterile mikrorør for oppbevaring ved -80o C. En separat vattpinne føres gjennom munnen og gnis over mandlene og bakre orofarynx, og lagret på samme måte.

Bredspektret PCR og høykapasitets DNA-sekvensering PCR-amplifisering og sekvensering av rRNA-gener vil følge vår tidligere publiserte protokoll (13). Kort fortalt utsettes DNA-lysater for PCR med panbakterielle 16S rDNA rDNA-primere, som gir biblioteker av PCR-amplikoner som er representative for alle bakterier eller sopp i en prøve (14). Triplikat PCR-reaksjoner vil bli utført og amplikoner samlet for hver prøve. Forgiftningskontroller tilsatt bakterielle (f.eks. Bacillus subtilis) genomisk DNA vil bli analysert for å påvise tilstedeværelsen av PCR-hemmere i mal DNA-preparater; Selv om det vanligvis ikke er et problem med neseprøver, vil hemmende prøver renses ved utfelling av etanol og deretter sendes inn på nytt for PCR. PCR-amplikonbiblioteker vil bli sekvensert ved å bruke Illumina MiSeqs personlige sekvenseringsplattform med høy ytelse. som er tilgjengelig gjennom University of Colorados avdeling for infeksjonssykdommer. Denne plattformen kan generere 5-20x106 DNA-sekvenser i et enkelt instrument som kjøres med gjennomsnittlige leselengder ~450 nts. Primerne som brukes for bredspektret PCR inkluderer unike strekkodede sekvenser for samtidig å sekvensere flere amplikonbiblioteker i en enkelt instrumentkjøring (15). Vi vil konstruere og sekvensere biblioteker fra 100 prøver (50 vedvarende MRSA-bærere [tilfeller] og 50 ikke-bærere [kontroller]) til en dybde på >50 000 høykvalitets sekvenseringsavlesninger per prøve. Vår foreløpige studie indikerer at denne dekningsdybden vil representere en fullstendig undersøkelse av nares mikrobiota for hver prøve.

Sekvensanalyse Mikrober som finnes i prøver vil bli identifisert ved bruk av det naive Bayesian Classifier Tool (16) fra Ribosomal Database Project (17). For å redusere den generelle kompleksiteten til datasettene, vil lignende rDNA-sekvenser bli gruppert i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) ved å gruppere sekvenser basert på taksonomiske tilordninger. Datamatriser blir deretter satt sammen som tabulerer frekvensen til hver OTU i en prøve. Prøvedekning for hvert amplikonbibliotek vil bli estimert (18-20) og ytterligere sekvenser screenet hvis dekningen er mindre enn 95 %. Alle sekvenser vil bli deponert i GenBank for offentlig bruk.

Validering av kandidatmikroorganismer Mikrober identifisert gjennom bredspektret rDNA-analyse som potensielt påvirkende S. aureus-kolonisering vil bli videre evaluert basert på målrettede QPCR-målinger. Basert på våre foreløpige resultater og tidligere publiserte studier som tyder på at de forstyrrer S. aureus-vekst, vil både S. epidermidis, (femA) og Corynebacterium spp., (rpoB PCR) bli oppregnet ved Q-PCR (tabell nedenfor). Primersett for Q-PCR-analyser av nye mikrobielle grupper vil bli designet for påvisning av rDNA-operoner (dvs. 16S-ITS-23S-gener) gjennom ARB-programvarepakken (21). Når det gjelder tidligere anerkjente mikrobielle grupper og/eller arter, kan PCR-primersett identifiseres ved litteratursøk.