Impact van Mupirocine-dekolonisatie op het neusmicrobioom

A. Uitkomstmaten: Dit is in wezen een beschrijvend onderzoek. We zullen de nasale microbiota definiëren voor en na dekolonisatietherapie met mupirocine.

B. Beschrijving van de in te schrijven populatie: Patiënten bij VA-Denver die beginnen met een kuur met nasale mupirocinetherapie voor dekolonisatie van S. aureus zullen worden ingeschreven. De gebruikelijke indicaties voor dekolonisatietherapie zijn de voorbereiding op een gewrichtsvervangende operatie en het gemakkelijker maken om de patiënt uit zijn isolement te halen voor een langdurig verblijf op de revalidatiedienst. Schriftelijke geïnformeerde toestemming zal worden verkregen.

C. Onderzoeksopzet en onderzoeksmethoden: vlak voor aanvang van de mupirocinetherapie wordt een neusuitstrijkje verkregen, binnen 48 uur na voltooiing van de mupirocinetherapie, één week, twee weken, vier weken, acht weken en 16 weken na voltooiing van mupirocinetherapie. Het wattenstaafje wordt in één neusgat gestoken en gedurende 3 seconden rondgedraaid. De procedure wordt herhaald op het andere neusgat. De twee koppen worden onmiddellijk gekoeld en op 2-5o C gehouden totdat ze in steriele microbuisjes kunnen worden geplaatst voor opslag bij -80o C. Een apart wattenstaafje wordt door de mond gehaald en over de amandelen en achterste orofarynx gewreven, en op dezelfde manier opgeslagen.

PCR met breed bereik en DNA-sequencing met hoge doorvoer PCR-amplificatie en sequentiebepaling van rRNA-genen zal ons eerder gepubliceerde protocol volgen (13). Kortom, DNA-lysaten worden onderworpen aan PCR met panbacteriële 16S rDNA rDNA-primers, wat bibliotheken van PCR-amplicons oplevert die representatief zijn voor alle bacteriën of schimmels in een monster (14). PCR-reacties in drievoud zullen worden uitgevoerd en amplicons worden samengevoegd voor elk monster. Vergiftigingscontroles verrijkt met bacteriën (bijv. Bacillus subtilis) genomisch DNA zal worden getest om de aanwezigheid van PCR-remmers in template-DNA-preparaten te detecteren; hoewel dit meestal geen probleem is met neusuitstrijkjes, zullen remmende monsters worden gezuiverd door ethanolprecipitatie en vervolgens opnieuw worden ingediend voor PCR. PCR-ampliconbibliotheken zullen worden gesequenced met behulp van het high-throughput Illumina MiSeq persoonlijke sequencing-platform. die beschikbaar is via de afdeling Infectieziekten van de Universiteit van Colorado. Dit platform kan 5-20x106 DNA-sequenties genereren in een enkele instrumentrun met een gemiddelde leeslengte van ~450 nts. De primers die worden gebruikt voor PCR met een breed bereik omvatten unieke sequenties met streepjescodes om gelijktijdig meerdere ampliconbibliotheken te sequensen in een enkele instrumentrun (15). We zullen bibliotheken construeren en sequensen van 100 specimens (50 persistente MRSA-dragers [gevallen] en 50 niet-dragers [controles]) tot een diepte van >50.000 hoogwaardige sequentielezingen per specimen. Onze voorlopige studie geeft aan dat deze dekkingsdiepte een volledig overzicht van de microbiota van de neusgaten voor elk exemplaar vertegenwoordigt.

Sequentieanalyse Microben die aanwezig zijn in specimens zullen worden geïdentificeerd door gebruik te maken van de Naïve Bayesiaanse classificatietool (16) van het Ribosomal Database Project (17). Om de algehele complexiteit van de datasets te verminderen, zullen vergelijkbare rDNA-sequenties worden geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) door sequenties te clusteren op basis van taxonomische toewijzingen. Vervolgens worden gegevensmatrices samengesteld die de frequentie van elke OTU in een steekproef weergeven. De bemonsteringsdekking voor elke amplicon-bibliotheek wordt geschat (18-20) en aanvullende sequenties worden gescreend als de dekking minder is dan 95%. Alle sequenties zullen worden gedeponeerd in GenBank voor openbaar gebruik.

Validatie van kandidaat-micro-organismen Microben die door middel van rDNA-analyse met een breed bereik zijn geïdentificeerd en mogelijk een invloed hebben op de kolonisatie van S. aureus, zullen verder worden geëvalueerd op basis van gerichte QPCR-metingen. Op basis van onze voorlopige resultaten en eerder gepubliceerde studies die hun interferentie met de groei van S. aureus suggereren, zullen zowel S. epidermidis, (femA) als Corynebacterium spp., (rpoB PCR) worden opgesomd door Q-PCR (tabel hieronder). Er zullen primersets voor Q-PCR-assays van nieuwe microbiële groepen worden ontworpen voor de detectie van rDNA-operons (d.w.z. 16S-ITS-23S-genen) via het ARB-softwarepakket (21). In het geval van eerder herkende microbiële groepen en/of soorten kunnen PCR-primersets worden geïdentificeerd door literatuuronderzoek.