鼻のマイクロバイオームに対するムピロシン脱コロニー化の影響

A. 結果測定: これは本質的に記述的研究です。 ムピロシンによる除菌療法の前後の鼻の微生物叢を定義します。

B. 登録対象集団の説明: VA-Denver で、黄色ブドウ球菌の除菌のために経鼻ムピロシン療法のコースを開始している患者が登録されます。 除菌療法の一般的な適応症は、関節置換手術の準備と、リハビリテーションサービスでの長期滞在のために患者を隔離から解放することです。 書面によるインフォームドコンセントが得られます。

C.研究デザインと研究方法：鼻スワブは、ムピロシン療法の開始直前、ムピロシン療法の完了から48時間以内、完了後1週間、2週間、4週間、8週間、および16週間以内に取得されますムピロシン療法の。 スワブを片方の鼻孔に挿入し、3 秒間回転させます。 この手順を他の鼻孔で繰り返します。 2 つの頭はすぐに冷蔵し、-80o C で保存するために滅菌マイクロ チューブに入れるまで 2 ～ 5o C に保ちます。同じ方法で保存されます。

広域 PCR およびハイスループット DNA シーケンシング rRNA 遺伝子の PCR 増幅およびシーケンシングは、以前に公開されたプロトコル (13) に従います。 簡単に言えば、DNA ライセートは、汎細菌 16S rDNA rDNA プライマーを用いた PCR にかけられ、標本中のすべての細菌または真菌を代表する PCR アンプリコンのライブラリーが生成されます (14)。 三重のＰＣＲ反応を実施し、各サンプルについてアンプリコンをプールする。 細菌でスパイクされた中毒コントロール（例： Bacillus subtilis) のゲノム DNA をアッセイして、テンプレート DNA 調製物中の PCR 阻害物質の存在を検出します。通常、鼻スワブでは問題ありませんが、阻害サンプルはエタノール沈殿によって精製され、PCR のために再提出されます。 PCR アンプリコン ライブラリーは、ハイスループット イルミナ MiSeq パーソナル シーケンス プラットフォームを使用してシーケンスされます。 これは、コロラド大学の感染症部門を通じて入手できます。 このプラットフォームは、1 回の実行で 5 ～ 20x106 個の DNA 配列を生成でき、平均読み取り長は約 450 nt です。 広域 PCR に使用されるプライマーには、1 回の装置実行で複数のアンプリコン ライブラリーを同時にシーケンシングするために、独自のバーコード シーケンスが含まれています (15)。 100 検体 (50 の永続的な MRSA キャリア [ケース] と 50 の非キャリア [コントロール]) からライブラリを構築し、1 検体あたり 50,000 を超える高品質のシーケンス読み取りの深さまでシーケンスします。 私たちの予備研究は、このカバー範囲の深さは、各標本の鼻孔微生物叢の完全な調査を表すことを示しています。

シーケンス分析 標本に存在する微生物は、リボソーム データベース プロジェクト (17) の Naive Bayesian Classifier Tool (16) を使用して識別されます。 データセットの全体的な複雑さを軽減するために、類似の rDNA シーケンスは、分類学的割り当てに基づいてシーケンスをクラスター化することにより、操作上の分類単位 (OTU) にクラスター化されます。 次に、サンプル内の各 OTU の頻度を集計するデータ マトリックスが作成されます。 各アンプリコン ライブラリのサンプリング カバレッジが推定され (18 ～ 20)、カバレッジが 95% 未満の場合は、追加のシーケンスがスクリーニングされます。 すべての配列は、公共の使用のために GenBank に寄託されます。

候補微生物の検証広範囲の rDNA 分析によって、黄色ブドウ球菌のコロニー形成に影響を与える可能性があると特定された微生物は、ターゲット QPCR 測定に基づいてさらに評価されます。 予備結果と黄色ブドウ球菌の増殖への干渉を示唆する以前に発表された研究に基づいて、表皮ブドウ球菌 (femA) とコリネバクテリウム属 (rpoB PCR) の両方が Q-PCR によって列挙されます (表、下)。 新規微生物グループの Q-PCR アッセイ用のプライマー セットは、rDNA オペロンの検出用に設計されます (つまり、 16S-ITS-23S 遺伝子) を ARB ソフトウェア パッケージ (21) 経由で。 以前に認識された微生物群および/または種の場合、PCRプライマーセットは文献検索によって特定される場合があります。