Влияние деколонизации мупироцином на назальный микробиом

A. Критерии результатов: Это, по существу, описательное исследование. Мы определим микробиоту носа до и после деколонизационной терапии мупироцином.

B. Описание популяции, подлежащей включению: Будут регистрироваться пациенты в VA-Denver, которые начинают курс назальной терапии мупироцином для деколонизации S. aureus. Общими показаниями к деколонизационной терапии являются подготовка к операции по замене сустава и облегчение выведения пациента из изоляции для длительного пребывания в реабилитационной службе. Письменное информированное согласие будет получено.

C. Дизайн исследования и методы исследования: мазок из носа будет получен непосредственно перед началом терапии мупироцином, в течение 48 часов после завершения терапии мупироцином, через одну неделю, две недели, четыре недели, восемь недель и 16 недель после завершения. терапии мупироцином. Тампон вводят в одну ноздрю и вращают в течение 3 секунд. Процедура будет повторена на другой ноздре. Две головы немедленно охлаждают и выдерживают при температуре 2-5°C до тех пор, пока их можно будет поместить в стерильные микропробирки для хранения при температуре -80°C. Отдельный тампон вводят через рот и протирают миндалины и заднюю часть ротоглотки, а затем хранится таким же образом.

Широкодиапазонная ПЦР и высокопроизводительное секвенирование ДНК ПЦР-амплификация и секвенирование генов рРНК будут следовать нашему ранее опубликованному протоколу (13). Вкратце, лизаты ДНК подвергают ПЦР с панбактериальными праймерами рДНК 16S рДНК, что дает библиотеки ПЦР-ампликонов, репрезентативных для всех бактерий или грибов в образце (14). Будут проведены тройные ПЦР-реакции, и для каждого образца будут объединены ампликоны. Средства контроля отравления, обогащенные бактериями (например, Bacillus subtilis) будет проведен анализ геномной ДНК для обнаружения присутствия ингибиторов ПЦР в препаратах матричной ДНК; хотя обычно это не проблема с мазками из носа, ингибирующие образцы очищают путем осаждения этанолом, а затем повторно отправляют на ПЦР. Библиотеки ампликонов ПЦР будут секвенированы с использованием высокопроизводительной персональной платформы секвенирования Illumina MiSeq. который можно получить в отделении инфекционных заболеваний Университета Колорадо. Эта платформа может генерировать 5-20x106 последовательностей ДНК за один запуск прибора со средней длиной считывания ~450 нт. Праймеры, используемые для ПЦР широкого диапазона, включают уникальные последовательности со штрих-кодом для одновременного секвенирования нескольких библиотек ампликонов за один запуск прибора (15). Мы создадим и секвенируем библиотеки из 100 образцов (50 стойких носителей MRSA [случаи] и 50 не носителей [контрольные]) до глубины >50 000 высококачественных прочтений секвенирования на образец. Наше предварительное исследование показывает, что такая глубина охвата будет представлять собой полное исследование микробиоты ноздрей для каждого образца.

Анализ последовательности Микробы, присутствующие в образцах, будут идентифицированы с помощью наивного байесовского классификатора (16) Проекта рибосомной базы данных (17). Чтобы уменьшить общую сложность наборов данных, похожие последовательности рДНК будут сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) путем кластеризации последовательностей на основе таксономических назначений. Затем собираются матрицы данных, которые сводят в таблицу частоту каждого OTU в выборке. Охват выборки для каждой библиотеки ампликонов будет оцениваться (18-20), а дополнительные последовательности будут подвергаться скринингу, если охват составляет менее 95%. Все последовательности будут депонированы в GenBank для публичного использования.

Проверка микроорганизмов-кандидатов Микробы, выявленные с помощью анализа рДНК широкого диапазона как потенциально воздействующие на колонизацию S. aureus, будут дополнительно оценены на основе целевых измерений количественной ПЦР. Основываясь на наших предварительных результатах и ​​ранее опубликованных исследованиях, которые предполагают их влияние на рост S. aureus, S. epidermidis (femA) и Corynebacterium spp. (rpoB PCR) будут перечислены с помощью Q-PCR (таблица ниже). Наборы праймеров для Q-PCR-анализа новых микробных групп будут разработаны для обнаружения оперонов рДНК (т.е. 16S-ITS-23S) с помощью программного пакета ARB (21). В случае ранее известных микробных групп и/или видов наборы праймеров для ПЦР могут быть идентифицированы путем поиска в литературе.