Einfluss der Dekolonisierung von Mupirocin auf das nasale Mikrobiom

A. Ergebnismessungen: Dies ist im Wesentlichen eine deskriptive Studie. Wir werden die nasale Mikrobiota vor und nach der Dekolonisationstherapie mit Mupirocin definieren.

B. Beschreibung der aufzunehmenden Population: Patienten in VA-Denver, die mit einer nasalen Mupirocin-Therapie zur Dekolonisierung von S. aureus beginnen, werden aufgenommen. Die üblichen Indikationen für die Dekolonisationstherapie sind die Vorbereitung auf Gelenkersatzoperationen und die Erleichterung der Entnahme des Patienten aus der Isolation für einen längeren Aufenthalt im Rehabilitationsdienst. Es wird eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

C. Studiendesign und Forschungsmethoden: Ein Nasenabstrich wird unmittelbar vor Beginn der Mupirocin-Therapie innerhalb von 48 Stunden nach Abschluss der Mupirocin-Therapie, eine Woche, zwei Wochen, vier Wochen, acht Wochen und 16 Wochen nach Abschluss entnommen der Mupirocin-Therapie. Der Tupfer wird in eine Nasenöffnung eingeführt und 3 Sekunden lang gedreht. Der Vorgang wird am anderen Nasenloch wiederholt. Die beiden Köpfe werden sofort gekühlt und bei 2–5 °C gehalten, bis sie zur Lagerung bei –80 °C in sterile Mikroröhrchen gegeben werden können. Ein separater Tupfer wird durch den Mund geführt und über die Mandeln und den hinteren Oropharynx gerieben in gleicher Weise gespeichert.

Breitband-PCR und Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung Die PCR-Amplifikation und Sequenzierung von rRNA-Genen folgt unserem zuvor veröffentlichten Protokoll (13). Kurz gesagt werden DNA-Lysate einer PCR mit panbakteriellen 16S-rDNA-rDNA-Primern unterzogen, was Bibliotheken von PCR-Amplikons ergibt, die für alle Bakterien oder Pilze in einer Probe repräsentativ sind (14). Dreifache PCR-Reaktionen werden durchgeführt und Amplikons werden für jede Probe gepoolt. Mit Bakterien versetzte Vergiftungskontrollen (z. Genomische DNA von Bacillus subtilis) wird getestet, um das Vorhandensein von PCR-Inhibitoren in Matrizen-DNA-Präparationen nachzuweisen; Obwohl dies bei Nasenabstrichen normalerweise kein Problem darstellt, werden inhibitorische Proben durch Ethanolpräzipitation gereinigt und dann erneut zur PCR eingereicht. PCR-Amplikon-Bibliotheken werden mit der persönlichen Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform MiSeq von Illumina sequenziert. die über die Abteilung für Infektionskrankheiten der Universität von Colorado erhältlich ist. Diese Plattform kann 5-20 x 106 DNA-Sequenzen in einem einzigen Gerätelauf mit mittleren Leselängen von ~450 nts generieren. Die für die Breitband-PCR verwendeten Primer enthalten eindeutige Barcode-Sequenzen, um gleichzeitig mehrere Amplikon-Bibliotheken in einem einzigen Gerätelauf zu sequenzieren (15). Wir erstellen und sequenzieren Bibliotheken aus 100 Proben (50 persistente MRSA-Träger [Fälle] und 50 Nicht-Träger [Kontrollen]) bis zu einer Tiefe von >50.000 qualitativ hochwertigen Sequenzierungs-Reads pro Probe. Unsere vorläufige Studie zeigt, dass diese Erfassungstiefe eine vollständige Untersuchung der Mikrobiota der Nasenlöcher für jede Probe darstellt.

Sequenzanalyse In Proben vorhandene Mikroben werden durch Verwendung des Naive Bayesian Classifier Tools (16) des Ribosomal Database Project (17) identifiziert. Um die Gesamtkomplexität der Datensätze zu reduzieren, werden ähnliche rDNA-Sequenzen in operationelle taxonomische Einheiten (OTUs) geclustert, indem Sequenzen basierend auf taxonomischen Zuordnungen geclustert werden. Dann werden Datenmatrizen zusammengestellt, die die Häufigkeit jeder OTU in einer Probe tabellieren. Die Stichprobenabdeckung für jede Amplikonbibliothek wird geschätzt (18-20) und zusätzliche Sequenzen werden gescreent, wenn die Abdeckung weniger als 95 % beträgt. Alle Sequenzen werden zur öffentlichen Nutzung in der GenBank hinterlegt.

Validierung von Kandidatenmikroorganismen Mikroben, die durch breit angelegte rDNA-Analyse als potentiell schädlich für die Besiedelung mit S. aureus identifiziert wurden, werden basierend auf gezielten QPCR-Messungen weiter evaluiert. Basierend auf unseren vorläufigen Ergebnissen und zuvor veröffentlichten Studien, die darauf hindeuten, dass sie das Wachstum von S. aureus beeinträchtigen, werden sowohl S. epidermidis (femA) als auch Corynebacterium spp. (rpoB-PCR) durch Q-PCR gezählt (Tabelle unten). Primer-Sets für Q-PCR-Assays neuer mikrobieller Gruppen werden zum Nachweis von rDNA-Operons (d. h. 16S-ITS-23S-Gene) durch das ARB-Softwarepaket (21). Im Fall von zuvor erkannten mikrobiellen Gruppen und/oder Spezies können PCR-Primer-Sets durch Literaturrecherche identifiziert werden.