Impacto da Descolonização da Mupirocina no Microbioma Nasal

A. Medidas de resultado: Este é essencialmente um estudo descritivo. Definiremos a microbiota nasal antes e após a terapia de descolonização com mupirocina.

B. Descrição da população a ser incluída: Serão incluídos pacientes no VA-Denver que estão iniciando um curso de terapia com mupirocina nasal para descolonização de S. aureus. As indicações comuns para a terapia de descolonização são a preparação para a cirurgia de substituição articular e para facilitar a remoção do paciente do isolamento para uma permanência prolongada no serviço de reabilitação. O consentimento informado por escrito será obtido.

C. Desenho do estudo e métodos de pesquisa: Um swab nasal será obtido imediatamente antes do início da terapia com mupirocina, dentro de 48 horas após o término da terapia com mupirocina, uma semana, duas semanas, quatro semanas, oito semanas e 16 semanas após o término da terapia com mupirocina. O cotonete será inserido em uma narina e girado por 3 segundos. O procedimento será repetido na outra narina. As duas cabeças serão refrigeradas imediatamente e mantidas a 2-5o C até que possam ser colocadas em microtubos estéreis para armazenamento a -80o C. Um swab separado será passado pela boca e esfregado sobre as amígdalas e orofaringe posterior, e armazenados da mesma forma.

PCR de amplo alcance e sequenciamento de DNA de alto rendimento A amplificação por PCR e o sequenciamento de genes de rRNA seguirão nosso protocolo publicado anteriormente (13). Em resumo, os lisados ​​de DNA são submetidos a PCR com primers 16S rDNA rDNA pan-bacterianos, que produzem bibliotecas de amplicons de PCR representativos de todas as bactérias ou fungos em uma amostra (14). As reações de PCR em triplicado serão realizadas e os amplicons agrupados para cada amostra. Controles de envenenamento enriquecidos com bactérias (p. O DNA genômico de Bacillus subtilis será testado para detectar a presença de inibidores de PCR em preparações de DNA molde; embora normalmente não seja um problema com zaragatoas nasais, as amostras inibitórias serão purificadas por precipitação com etanol e depois reenviadas para PCR. As bibliotecas de amplicons de PCR serão sequenciadas usando a plataforma de sequenciamento pessoal Illumina MiSeq de alto rendimento. que está disponível através da Divisão de Doenças Infecciosas da Universidade do Colorado. Esta plataforma pode gerar 5-20x106 sequências de DNA em um único instrumento executado com comprimentos médios de leitura de ~450 nts. Os primers usados ​​para PCR de amplo alcance incluem sequências únicas com código de barras para sequenciar simultaneamente várias bibliotecas de amplicons em uma única execução de instrumento (15). Construiremos e sequenciaremos bibliotecas de 100 espécimes (50 portadores persistentes de MRSA [casos] e 50 não portadores [controles]) a uma profundidade de > 50.000 leituras de sequenciamento de alta qualidade por espécime. Nosso estudo preliminar indica que essa profundidade de cobertura representará uma pesquisa completa da microbiota das narinas para cada espécime.

Análise de Sequência Os micróbios presentes nas amostras serão identificados através do uso da ferramenta Naïve Bayesian Classifier (16) do Ribosomal Database Project (17). Para reduzir a complexidade geral dos conjuntos de dados, sequências de rDNA semelhantes serão agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) agrupando sequências com base em atribuições taxonômicas. Matrizes de dados são então montadas que tabulam a frequência de cada OTU em uma amostra. A cobertura de amostragem para cada biblioteca de amplicon será estimada (18-20) e sequências adicionais serão rastreadas se a cobertura for inferior a 95%. Todas as sequências serão depositadas no GenBank para uso público.

Validação de microrganismos candidatos Os micróbios identificados por meio da análise de rDNA de amplo alcance como potencialmente impactantes na colonização de S. aureus serão avaliados com base em medições de QPCR direcionadas. Com base em nossos resultados preliminares e estudos publicados anteriormente que sugerem sua interferência no crescimento de S. aureus, S. epidermidis, (femA) e Corynebacterium spp., (rpoB PCR) serão enumerados por Q-PCR (Tabela, abaixo). Conjuntos de primers para ensaios de Q-PCR de novos grupos microbianos serão projetados para detecção de operons de rDNA (i.e. genes 16S-ITS-23S) através do pacote de software ARB (21). No caso de grupos e/ou espécies microbianas previamente reconhecidas, os conjuntos de primers de PCR podem ser identificados por pesquisa na literatura.