Impacto de la descolonización de mupirocina en el microbioma nasal

A. Medidas de resultado: Este es esencialmente un estudio descriptivo. Definiremos la microbiota nasal antes y después de la terapia de descolonización con mupirocina.

B. Descripción de la población que se inscribirá: se inscribirán los pacientes de VA-Denver que estén comenzando un tratamiento con mupirocina nasal para la descolonización de S. aureus. Las indicaciones comunes para la terapia de descolonización son la preparación para la cirugía de reemplazo articular y para facilitar la salida del aislamiento del paciente para una estadía prolongada en el servicio de rehabilitación. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito.

C. Diseño del estudio y métodos de investigación: se obtendrá un hisopo nasal justo antes de iniciar la terapia con mupirocina, dentro de las 48 horas posteriores a la finalización de la terapia con mupirocina, una semana, dos semanas, cuatro semanas, ocho semanas y 16 semanas después de la finalización. de la terapia con mupirocina. El hisopo se insertará en una de las fosas nasales y se girará durante 3 segundos. El procedimiento se repetirá en la otra nariz. Las dos cabezas se refrigerarán inmediatamente y se mantendrán entre 2 y 5 °C hasta que puedan colocarse en microtubos estériles para su almacenamiento a -80 °C. Se pasará un hisopo por la boca y se frotará sobre las amígdalas y la orofaringe posterior, y almacenados de la misma manera.

PCR de amplio rango y secuenciación de ADN de alto rendimiento La amplificación por PCR y la secuenciación de genes de ARNr seguirán nuestro protocolo publicado anteriormente (13). En resumen, los lisados ​​de ADN se someten a PCR con cebadores de ADNr de ADNr 16S panbacteriano, lo que produce bibliotecas de amplicones de PCR representativos de todas las bacterias u hongos en una muestra (14). Se realizarán reacciones de PCR por triplicado y se combinarán los amplicones para cada muestra. Controles de envenenamiento enriquecidos con bacterias (p. Se analizará el ADN genómico de Bacillus subtilis) para detectar la presencia de inhibidores de la PCR en las preparaciones de ADN molde; aunque no suele ser un problema con los hisopos nasales, las muestras inhibidoras se purificarán mediante precipitación con etanol y luego se volverán a enviar para PCR. Las bibliotecas de amplicones de PCR se secuenciarán utilizando la plataforma de secuenciación personal Illumina MiSeq de alto rendimiento. que está disponible a través de la División de Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Colorado. Esta plataforma puede generar de 5 a 20x106 secuencias de ADN en una sola ejecución de instrumento con longitudes de lectura medias de ~450 nts. Los cebadores utilizados para la PCR de amplio rango incluyen secuencias con códigos de barras únicas para secuenciar simultáneamente múltiples bibliotecas de amplicones en una sola ejecución del instrumento (15). Construiremos y secuenciaremos bibliotecas a partir de 100 especímenes (50 portadores persistentes de MRSA [casos] y 50 no portadores [controles]) hasta una profundidad de >50 000 lecturas de secuenciación de alta calidad por espécimen. Nuestro estudio preliminar indica que esta profundidad de cobertura representará un estudio completo de la microbiota nasal de cada espécimen.

Análisis de secuencia Los microbios presentes en las muestras se identificarán mediante el uso de la herramienta de clasificación bayesiana ingenua (16) del proyecto de base de datos ribosomal (17). Para reducir la complejidad general de los conjuntos de datos, las secuencias de ADNr similares se agruparán en unidades taxonómicas operativas (OTU) mediante la agrupación de secuencias en función de las asignaciones taxonómicas. Luego se ensamblan matrices de datos que tabulan la frecuencia de cada OTU en una muestra. Se estimará la cobertura de muestreo para cada biblioteca de amplicón (18-20) y se examinarán secuencias adicionales si la cobertura es inferior al 95 %. Todas las secuencias se depositarán en GenBank para uso público.

Validación de microorganismos candidatos Los microbios identificados a través del análisis de ADNr de amplio rango como potencialmente impactantes en la colonización de S. aureus se evaluarán más a fondo en función de las mediciones de QPCR específicas. Según nuestros resultados preliminares y estudios publicados anteriormente que sugieren su interferencia con el crecimiento de S. aureus, tanto S. epidermidis (femA) como Corynebacterium spp. (rpoB PCR) se enumerarán mediante Q-PCR (Tabla a continuación). Se diseñarán conjuntos de cebadores para ensayos Q-PCR de nuevos grupos microbianos para la detección de operones de ADNr (es decir, genes 16S-ITS-23S) a través del paquete de software ARB (21). En el caso de grupos y/o especies microbianos previamente reconocidos, los conjuntos de cebadores de PCR pueden identificarse mediante una búsqueda bibliográfica.