Vliv dekolonizace mupirocinu na nosní mikrobiom

A. Výsledky: Toto je v podstatě popisná studie. Definujeme nosní mikrobiotu před a po dekolonizační terapii mupirocinem.

B. Popis populace, která má být zapsána: Budou zařazeni pacienti ve VA-Denver, kteří zahajují léčbu nazálním mupirocinem pro dekolonizaci S. aureus. Běžnou indikací dekolonizační terapie je příprava na operaci kloubní náhrady a usnadnění vyjmutí pacienta z izolace k dlouhodobému pobytu na rehabilitační službě. Bude získán písemný informovaný souhlas.

C. Návrh studie a metody výzkumu: Výtěr z nosu bude odebrán těsně před zahájením léčby mupirocinem, do 48 hodin po ukončení léčby mupirocinem, jeden týden, dva týdny, čtyři týdny, osm týdnů a 16 týdnů po ukončení léčby mupirocinovou terapii. Tampón se vloží do jednoho nosu a otáčí se po dobu 3 sekund. Postup se bude opakovat na druhém nare. Dvě hlavy budou okamžitě zchlazeny a udržovány při teplotě 2-5 °C, dokud je nebude možné umístit do sterilních mikrozkumavek pro skladování při -80 °C. uloženy stejným způsobem.

Širokopásmová PCR a vysoce výkonné sekvenování DNA PCR amplifikace a sekvenování genů rRNA se bude řídit naším dříve publikovaným protokolem (13). Stručně řečeno, lyzáty DNA jsou podrobeny PCR s pan-bakteriálními 16S rDNA rDNA primery, která poskytuje knihovny PCR amplikonů reprezentativních pro všechny bakterie nebo houby ve vzorku (14). Provedou se trojité PCR reakce a amplikony se spojí pro každý vzorek. Kontroly otravy obohacené bakteriálními (např. Bacillus subtilis) bude testována genomová DNA k detekci přítomnosti inhibitorů PCR v preparátech templátové DNA; ačkoli to není typicky problém s nazálními výtěry, inhibiční vzorky budou purifikovány srážením ethanolem a poté znovu odeslány k PCR. Knihovny amplikonů PCR budou sekvenovány pomocí vysoce výkonné osobní sekvenační platformy Illumina MiSeq. který je k dispozici prostřednictvím oddělení infekčních chorob University of Colorado. Tato platforma může generovat 5-20x106 sekvencí DNA v jednom běhu na přístroji s průměrnou délkou čtení ~450 nts. Primery používané pro širokorozsahovou PCR zahrnují jedinečné sekvence s čárovým kódem, aby bylo možné simultánně sekvenovat více knihoven amplikonů v jednom cyklu (15). Zkonstruujeme a sekvenujeme knihovny ze 100 vzorků (50 perzistentních přenašečů MRSA [případy] a 50 nepřenašečů [kontroly]) do hloubky >50 000 vysoce kvalitních sekvenačních čtení na vzorek. Naše předběžná studie naznačuje, že tato hloubka pokrytí bude představovat kompletní průzkum mikrobioty nosních dutin pro každý vzorek.

Sekvenční analýza Mikroby přítomné ve vzorcích budou identifikovány pomocí naivního Bayesian Classifier Tool (16) projektu Ribosomal Database Project (17). Aby se snížila celková složitost souborů dat, budou podobné sekvence rDNA seskupeny do operačních taxonomických jednotek (OTU) shlukováním sekvencí na základě taxonomických přiřazení. Poté jsou sestaveny datové matice, které tabulkují frekvenci každé OTU ve vzorku. Pokrytí vzorkováním pro každou knihovnu amplikonů bude odhadnuto (18-20) a pokud je pokrytí nižší než 95 %, budou podrobeny screeningu další sekvence. Všechny sekvence budou uloženy do GenBank pro veřejné použití.

Validace kandidátních mikroorganismů Mikroby identifikované pomocí širokospektrální analýzy rDNA jako potenciálně ovlivňující kolonizaci S. aureus budou dále hodnoceny na základě cílených měření QPCR. Na základě našich předběžných výsledků a dříve publikovaných studií, které naznačují jejich interferenci s růstem S. aureus, budou pomocí Q-PCR vyčísleny S. epidermidis (femA) a Corynebacterium spp. (rpoB PCR) (tabulka níže). Sady primerů pro Q-PCR testy nových mikrobiálních skupin budou navrženy pro detekci rDNA operonů (tj. 16S-ITS-23S geny) prostřednictvím softwarového balíčku ARB (21). V případě dříve rozpoznaných mikrobiálních skupin a/nebo druhů mohou být sady PCR primerů identifikovány vyhledáváním v literatuře.