비강 마이크로바이옴에 대한 Mupirocin Decolonization의 영향

A. 결과 측정: 이것은 본질적으로 기술적인 연구입니다. 우리는 무피로신을 이용한 탈식민화 요법 전후의 비강 미생물총을 정의할 것입니다.

B. 등록할 모집단 설명: S. 아우레우스 탈집락화를 위한 비강 무피로신 치료 과정을 시작하는 VA-Denver의 환자가 등록됩니다. 탈식민화 요법의 일반적인 적응증은 관절 교체 수술을 준비하고 재활 서비스에 장기간 머무르기 위해 환자를 격리에서 쉽게 제거하는 것입니다. 서면 동의서를 받게 됩니다.

C. 연구 설계 및 연구 방법: 무피로신 요법 시작 직전, 무피로신 요법 완료 후 48시간 이내, 완료 후 1주, 2주, 4주, 8주 및 16주에 코 면봉을 채취한다. 무피로신 요법. 면봉을 하나의 콧구멍에 삽입하고 3초 동안 회전시킵니다. 절차는 다른 콧구멍에서 반복됩니다. 두 개의 헤드는 즉시 냉장 보관되며 -80oC에서 보관하기 위해 멸균 마이크로 튜브에 넣을 수 있을 때까지 2-5oC에서 보관됩니다. 별도의 면봉을 입을 통해 통과시키고 편도선과 후인두를 문지릅니다. 같은 방식으로 저장됩니다.

Broad-Range PCR 및 높은 처리량 DNA 시퀀싱 rRNA 유전자의 PCR 증폭 및 시퀀싱은 이전에 발표된 프로토콜을 따릅니다(13). 요컨대, DNA 용해물은 범박테리아 16S rDNA rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 표본의 모든 박테리아 또는 진균을 대표하는 PCR 앰플리콘 라이브러리를 생성합니다(14). 3중 PCR 반응이 수행되고 각 샘플에 대해 앰플리콘이 풀링됩니다. 세균이 첨가된 중독 통제(예: Bacillus subtilis) 게놈 DNA는 주형 DNA 준비에서 PCR 억제제의 존재를 검출하기 위해 분석됩니다. 비강 면봉으로 일반적으로 문제가 되지는 않지만 억제 샘플은 에탄올 침전으로 정제한 다음 PCR을 위해 다시 제출합니다. PCR amplicon 라이브러리는 처리량이 많은 Illumina MiSeq 개인 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 이는 콜로라도 대학의 전염병 부서를 통해 이용 가능합니다. 이 플랫폼은 평균 판독 길이가 ~450nts인 단일 기기 실행에서 5-20x106 DNA 시퀀스를 생성할 수 있습니다. 광범위한 PCR에 사용되는 프라이머에는 단일 기기 실행에서 여러 amplicon 라이브러리를 동시에 시퀀싱하기 위해 고유한 바코드 시퀀스가 ​​포함됩니다(15). 우리는 100개의 표본(50개의 영구 MRSA 캐리어[케이스] 및 50개의 비캐리어[컨트롤])에서 샘플당 >50,000 고품질 시퀀싱 판독의 깊이까지 라이브러리를 구성하고 시퀀싱할 것입니다. 우리의 예비 연구는 이 범위의 깊이가 각 표본에 대한 나레스 미생물총의 완전한 조사를 나타낼 것임을 나타냅니다.

표본에 존재하는 서열 분석 미생물은 Ribosomal Database Project(17)의 Naive Bayesian Classifier Tool(16)을 사용하여 식별됩니다. 데이터 세트의 전반적인 복잡성을 줄이기 위해 유사한 rDNA 서열은 분류학적 할당을 기반으로 시퀀스를 클러스터링하여 운영 분류 단위(OTU)로 클러스터링됩니다. 그런 다음 샘플의 각 OTU 빈도를 표로 만드는 데이터 매트릭스가 조립됩니다. 각 앰플리콘 라이브러리에 대한 샘플링 범위가 추정되고(18-20) 범위가 95% 미만인 경우 추가 시퀀스가 ​​스크리닝됩니다. 모든 시퀀스는 공공 사용을 위해 GenBank에 보관됩니다.

후보 미생물 검증 광역 rDNA 분석을 통해 잠재적으로 S. aureus 집락화에 영향을 미치는 것으로 확인된 미생물은 표적 QPCR 측정을 기반으로 추가 평가됩니다. S. aureus 성장에 대한 간섭을 제안하는 예비 결과 및 이전에 발표된 연구를 기반으로 S. epidermidis(femA) 및 Corynebacterium spp.(rpoB PCR) 모두 Q-PCR에 의해 열거될 것입니다(아래 표). 새로운 미생물 그룹의 Q-PCR 분석을 위한 프라이머 세트는 rDNA 오페론(즉, 16S-ITS-23S 유전자) ARB 소프트웨어 패키지를 통해(21). 이전에 알려진 미생물 그룹 및/또는 종의 경우 문헌 검색을 통해 PCR 프라이머 세트를 확인할 수 있습니다.