Virkningen af ​​Mupirocin-dekolonisering på det nasale mikrobiom

A. Resultatmål: Dette er i det væsentlige en beskrivende undersøgelse. Vi vil definere den nasale mikrobiota før og efter afkoloniseringsterapi med mupirocin.

B. Beskrivelse af population, der skal indskrives: Patienter på VA-Denver, der starter et forløb med nasal mupirocinbehandling til S. aureus-dekolonisering, vil blive indskrevet. De almindelige indikationer for afkoloniseringsterapi er forberedelse til ledprotesekirurgi og at lette fjernelse af patient fra isolation til et længerevarende ophold på rehabiliteringstjenesten. Der vil blive indhentet skriftligt informeret samtykke.

C. Undersøgelsesdesign og forskningsmetoder: En næsepodning vil blive udtaget lige før påbegyndelse af mupirocinbehandling, inden for 48 timer efter afslutning af mupirocinbehandling, en uge, to uger, fire uger, otte uger og 16 uger efter afslutningen af mupirocinbehandling. Podepinden vil blive indsat i den ene nakke og roteret i 3 sekunder. Proceduren vil blive gentaget på den anden nare. De to hoveder afkøles øjeblikkeligt og holdes ved 2-5o C, indtil de kan anbringes i sterile mikrorør til opbevaring ved -80o C. En separat podepind føres gennem munden og gnides over mandlerne og den bageste oropharynx, og opbevares på samme måde.

Bredvidde PCR og High throughput DNA-sekventering PCR-amplifikation og sekventering af rRNA-gener vil følge vores tidligere offentliggjorte protokol (13). Kort fortalt udsættes DNA-lysater for PCR med panbakterielle 16S rDNA rDNA-primere, hvilket giver biblioteker af PCR-amplikoner, der er repræsentative for alle bakterier eller svampe i en prøve (14). Tredobbelte PCR-reaktioner vil blive udført, og amplikoner samles for hver prøve. Forgiftningskontroller tilsat bakterielle (f.eks. Bacillus subtilis) genomisk DNA vil blive analyseret for at påvise tilstedeværelsen af ​​PCR-hæmmere i skabelon-DNA-præparater; selvom det typisk ikke er et problem med næsepodninger, vil hæmmende prøver blive renset ved ethanoludfældning og derefter genindsendt til PCR. PCR amplikon biblioteker vil blive sekventeret ved hjælp af high-throughput Illumina MiSeq personlige sekventeringsplatform. som er tilgængelig gennem University of Colorado's Division of Infectious Diseases. Denne platform kan generere 5-20x106 DNA-sekvenser i et enkelt instrument, der køres med gennemsnitlige læselængder ~450 nts. De primere, der anvendes til bredspektret PCR, omfatter unikke stregkodede sekvenser for samtidig at sekventere flere amplikonbiblioteker i en enkelt instrumentkørsel (15). Vi vil konstruere og sekventere biblioteker fra 100 prøver (50 persistente MRSA-bærere [tilfælde] og 50 ikke-bærere [kontroller]) til en dybde på >50.000 højkvalitets sekventeringsaflæsninger pr. prøve. Vores foreløbige undersøgelse indikerer, at denne dybde af dækning vil repræsentere en komplet undersøgelse af nares mikrobiota for hver prøve.

Sekvensanalyse Mikrober, der findes i prøver, vil blive identificeret ved brug af det naive Bayesian Classifier Tool (16) fra Ribosomal Database Project (17). For at reducere den overordnede kompleksitet af datasættene vil lignende rDNA-sekvenser blive grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) ved at klynge sekvenser baseret på taksonomiske tildelinger. Datamatricer samles derefter, der tabulerer frekvensen af ​​hver OTU i en prøve. Prøveudtagningsdækning for hvert amplikonbibliotek vil blive estimeret (18-20), og yderligere sekvenser screenes, hvis dækningen er mindre end 95 %. Alle sekvenser vil blive deponeret i GenBank til offentlig brug.

Validering af kandidatmikroorganismer Mikrober identificeret gennem bred rDNA-analyse som potentielt påvirkende S. aureus-kolonisering vil blive yderligere evalueret baseret på målrettede QPCR-målinger. Baseret på vores foreløbige resultater og tidligere publicerede undersøgelser, der tyder på deres interferens med S. aureus vækst, vil både S. epidermidis, (femA) og Corynebacterium spp., (rpoB PCR) blive opregnet ved Q-PCR (tabel nedenfor). Primersæt til Q-PCR-assays af nye mikrobielle grupper vil blive designet til påvisning af rDNA-operoner (dvs. 16S-ITS-23S gener) gennem ARB-softwarepakken (21). I tilfælde af tidligere anerkendte mikrobielle grupper og/eller arter kan PCR-primersæt identificeres ved litteratursøgning.