Impact de la décolonisation de la mupirocine sur le microbiome nasal

A. Mesures des résultats : Il s'agit essentiellement d'une étude descriptive. Nous définirons le microbiote nasal avant et après traitement de décolonisation par la mupirocine.

B. Description de la population à inscrire : les patients de VA-Denver qui commencent un traitement par mupirocine nasale pour la décolonisation de S. aureus seront inscrits. Les indications courantes de la thérapie de décolonisation sont la préparation à la chirurgie de remplacement articulaire et pour faciliter la sortie du patient de l'isolement pour un séjour prolongé dans le service de réadaptation. Un consentement éclairé écrit sera obtenu.

C. Conception de l'étude et méthodes de recherche : un prélèvement nasal sera obtenu juste avant le début du traitement par la mupirocine, dans les 48 heures suivant la fin du traitement par la mupirocine, une semaine, deux semaines, quatre semaines, huit semaines et 16 semaines après la fin du traitement. du traitement par la mupirocine. L'écouvillon sera inséré dans un narine et tourné pendant 3 secondes. La procédure sera répétée sur l'autre narine. Les deux têtes seront immédiatement réfrigérées et maintenues à 2-5o C jusqu'à ce qu'elles puissent être placées dans des microtubes stériles pour un stockage à -80o C. Un écouvillon séparé sera passé par la bouche et frotté sur les amygdales et l'oropharynx postérieur , et stockés de la même manière.

PCR à large portée et séquençage d'ADN à haut débit L'amplification par PCR et le séquençage des gènes d'ARNr suivront notre protocole publié précédemment (13). En bref, les lysats d'ADN sont soumis à une PCR avec des amorces d'ADNr 16S panbactériennes, ce qui donne des bibliothèques d'amplicons PCR représentatifs de toutes les bactéries ou champignons d'un échantillon (14). Des réactions PCR en triple seront effectuées et les amplicons seront regroupés pour chaque échantillon. Contrôles d'empoisonnement dopés avec des bactéries (par ex. L'ADN génomique de Bacillus subtilis) sera dosé pour détecter la présence d'inhibiteurs de PCR dans les préparations d'ADN matrice ; bien que ce ne soit généralement pas un problème avec les écouvillons nasaux, les échantillons inhibiteurs seront purifiés par précipitation à l'éthanol, puis soumis à nouveau pour PCR. Les bibliothèques d'amplicons PCR seront séquencées à l'aide de la plateforme de séquençage personnel à haut débit Illumina MiSeq. qui est disponible auprès de la Division des maladies infectieuses de l'Université du Colorado. Cette plate-forme peut générer des séquences d'ADN de 5 à 20 x 106 en un seul instrument avec des longueurs de lecture moyennes d'environ 450 nts. Les amorces utilisées pour la PCR à large gamme comprennent des séquences à code-barres uniques afin de séquencer simultanément plusieurs bibliothèques d'amplicons dans un seul instrument (15). Nous construirons et séquencerons des bibliothèques à partir de 100 échantillons (50 porteurs persistants de SARM [cas] et 50 non porteurs [témoins]) jusqu'à une profondeur de > 50 000 lectures de séquençage de haute qualité par échantillon. Notre étude préliminaire indique que cette profondeur de couverture représentera une étude complète du microbiote des narines pour chaque spécimen.

Analyse de séquence Les microbes présents dans les spécimens seront identifiés grâce à l'utilisation de l'outil de classification bayésien naïf (16) du projet de base de données ribosomique (17). Pour réduire la complexité globale des ensembles de données, des séquences d'ADNr similaires seront regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) en regroupant les séquences en fonction des attributions taxonomiques. Des matrices de données sont ensuite assemblées pour tabuler la fréquence de chaque OTU dans un échantillon. La couverture d'échantillonnage pour chaque bibliothèque d'amplicons sera estimée (18-20) et des séquences supplémentaires seront examinées si la couverture est inférieure à 95 %. Toutes les séquences seront déposées dans GenBank pour un usage public.

Validation des micro-organismes candidats Les microbes identifiés par une analyse d'ADNr à large spectre comme pouvant avoir un impact sur la colonisation de S. aureus seront évalués plus en détail sur la base de mesures QPCR ciblées. Sur la base de nos résultats préliminaires et d'études publiées précédemment qui suggèrent leur interférence avec la croissance de S. aureus, S. epidermidis, (femA) et Corynebacterium spp., (rpoB PCR) seront dénombrés par Q-PCR (tableau ci-dessous). Des ensembles d'amorces pour les tests Q-PCR de nouveaux groupes microbiens seront conçus pour la détection des opérons d'ADNr (c'est-à-dire gènes 16S-ITS-23S) via le progiciel ARB (21). Dans le cas de groupes et/ou d'espèces microbiens précédemment reconnus, des ensembles d'amorces PCR peuvent être identifiés par une recherche documentaire.