Koliinilisä sikiön kasvuun raskausdiabetes mellituksessa

TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Erityistavoite 1: Selvitä raskaudenaikainen MCS:n vaikutus syntymäpainoon GDM:ssä.

Erityinen tavoite 2: Määritä MCS:n vaikutus makroravinteiden kuljetukseen ja epigeneettisiin modifikaatioihin istukassa ja napanuoraveressä.

HYPOTEESI

Tavoite 1: Tutkijat olettavat, että koliiniryhmällä olisi pienempi syntymäpaino ja vähemmän LGA-vastasyntyneitä kuin ei-koliiniryhmässä.

Tavoite 2: Tutkijat olettavat, että koliiniryhmä vähentäisi istukan kuljetusta ja lisää metabolisten geenien DNA-metylaatiota.

OPINTUSUUNNITTELU

Aiheet: Otetaan käyttöön kätevä näytteenottomenetelmä. Tutkijat rekrytoivat raskaana olevia naisia, joilla on diagnosoitu GDM toisen raskauskolmanneksen aikana. Lohkosatunnaistaminen tehdään hoitomenetelmien (esim. insuliinihoito, oraaliset hypoglykeemiset lääkkeet tai pelkkä ruokavalio) jakamaan osallistujat satunnaisesti interventio- ja kontrolliryhmiin. Rekrytointi suoritetaan seuraavilla menetelmillä: (i) tutkimuslehtiset postitetaan synnytystä edeltävälle klinikalle; (ii) tutkijat tunnistavat raskaana olevat naiset, jotka ovat mahdollisesti kelvollisia tarkastelemalla potilastietoja.

Kelpoisuuskriteerit: Osallistumiskriteerit sisältävät GDM-raskaana olevat naiset ennen raskausviikkoa 28. GDM diagnosoidaan 2-vaiheisella prosessilla: verensokeri ylittää 140 mg/dl:n raja-arvon 50 g:n ei-paastottoman 1 tunnin ja 100 g:n 3 tunnin oraalisen glukoosialtistuksen jälkeen. Raskaana olevat naiset ovat kelpoisia osallistumaan, jos he ovat englannin tai espanjankielisiä, yli 18-vuotiaita, joilla on yksittäinen raskaus, aikovat synnyttää lapsensa laitoksessa ja heillä ei ole mitään poissulkemiskriteereissä lueteltuja ehtoja. Poissulkemiskriteereitä ovat olemassa oleva hyperglykemia, diabetes, sydän- ja verisuonisairaudet ja maksasairaus ennen raskautta. Potilaat voivat halutessaan osallistua tutkimukseen eivätkä luovuttaa istukasta tai napanuorasta otettua biopsiaa. Potilaat, jotka haluavat kantasolujen luovutuksen tai varastoinnin, eivät voi luovuttaa istukasta tai napanuorasta koepalaa. Näitä potilaita ei suljeta pois ensisijaisesta analyysistä.

Suunnittelu- ja tiedonkeruumenettelyt:

Kaikki vuorovaikutus osallistujien kanssa tapahtuu toimittavassa sairaalassa, kun taas näyteanalyysit tehdään yliopistossa, jossa avustavan tutkijan laboratorio sijaitsee. Tutkimuksen koordinaattori, jota avustavat tutkijat (Brooklyn College), ei pääse käsiksi tai tallenna tietoja etänä, ja kaikki tiedonkeruu ja -analyysi tapahtuu sairaalan kampuksella.

Tutkijat hankkivat raskaana olevilta naisilta kirjallisen suostumuksen ennen tutkimukseen tuloa. Satunnaistuksen tekee apteekki, kun potilas on allekirjoittanut suostumuksensa. Se on 6 potilaan blokisatunnaistaminen. Satunnaistamisen jälkeen tutkijat antavat interventioryhmän osallistujalle koliinilisäpillereitä, jotka sisältävät 500 mg koliinibitartraattia (235 mg koliinia, Douglas Lab). Osallistuja kuluttaa 2 pilleriä päivässä saadakseen 470 mg koliinia 8 viikon ajan. Suositeltu koliinin saanti riittävän saannin (AI) muodossa on 450 mg/d raskaana oleville naisille ja siedettävä ylempi saantitaso (UL) on 3500 mg/d. Koska alle 10 % raskaana olevista naisista saavuttaa koliinin saannin AI:n ja koliinin saannin ylempi kvartiili on alle 900 mg/d. Annos, jonka tutkijat tarjoavat plus tavanomainen koliinin saanti näillä raskaana olevilla naisilla, jää AI:n ja UL:n väliin, eli riittävä, mutta ei ylitä rajaa. Kontrolliryhmän osallistujat saavat lumelääkettä. Molemmat ryhmät saavat myös tavallisia synnytystä edeltäviä monivitamiinivalmisteita. Tutkijat antavat osallistujille 5 viikon lisäravinteet, ja tutkijat varmistavat, että he noudattavat ajan kuluessa päivittäisiä lisäravinteiden kulutuksen ja pillerijäämien määrän seurantalokia seuraavan käynnin aikana.

Osallistujat tulevat yhteensä 3 käyntiin rutiininomaisen kliinisen hoidon aikana. Ensimmäinen käynti on 24-28 raskausviikkoa, kun tutkijat rekisteröivät osallistujat, toinen käynti on 28-32 raskausviikkoa ja kolmas käynti 32-36 raskausviikkona. Tutkijat keräävät peruskyselylomakkeen ensimmäisellä käynnillä (noin 20 minuuttia), suorittavat 3 päivän ruokavalion muistiinpanot ensimmäisen käynnin jälkeen (noin 20 minuuttia kukin) ja tarkistavat nykyisen painon ja keräävät 20 ml verinäytteitä kaikilla käynneillä. Toimituksen yhteydessä tutkijat keräävät osallistujilta istukkanäytteet ja napanuoraveren.

Peruskyselylomake: Kyselylomake sisältää demografisia ja lääketieteellisiä tietoja, kuten ikä, eräpäivä, etnisyys, pariteetti, siviilisääty, koulutustaso, ammatti, kotitalouden tulot, sairausvakuutus, päihteiden käyttö, lääkkeiden käyttö, ravintolisät, kroonisten sairauksien sukuhistoria, ja itse ilmoittama paino ennen raskautta.

Ruokavalion arviointi: Koulutettu tutkimusassistentti (RA) hankkii jokaiselta osallistujalta kolme 24 tunnin ruokavalion palautusta, 2 arkipäivisin ja 1 viikonloppuna, puhelimitse ensimmäisten käyntien jälkeen määrittääkseen ravinnon koliinin saannin. Harnackin ja kollegoiden monipäästömenetelmää käytetään. RA tallentaa elintarvikkeiden tunnisteen, määrän, ainesosien spesifikaation, valmistusmenetelmän ja syöttää tiedot Nutrition Data System for Research (NDSR) -ohjelmistoon analysoidakseen koliinin saannin. RA myös kysyy osallistujilta heidän fyysisestä aktiivisuudestaan ​​(PA) viimeisen 24 tunnin aikana käyttämällä PA-kutsulaitetta.

Antropometriset mittaukset ja verenotto: Tutkijat mittaavat käyntien aikana osallistujien painon ja pituuden lääketieteellisellä vaa'alla, jossa on mekaaniset korkeussauvat. Ruoasta aiheutuvien plasman biomarkkereiden pitoisuuksien erojen minimoimiseksi osallistujia neuvotaan olemaan syömättä ruokaa vähintään 4 tuntiin ennen aamun verenottoa. Tämä on tavallinen suositus synnytystä edeltäville käynneille ja sitä pidetään turvallisena. Jokaiselta osallistujalta otetaan tutkijan käyntien aikana noin 20 ml paastolaskimoverta. Verinäytteet kerätään yhteen EDTA-verenkeräysputkeen ja yhteen seerumierotinputkeen ja sentrifugoidaan plasman, buffy coatin ja seerumin saamiseksi. Näytteet käsitellään ja säilytetään -80 oC:ssa laboratoriossa, kunnes niitä käytetään analyyttisiin mittauksiin.

Verensokerin hallinta: Tutkijat saavat tietoa paastoglukoosista, hemoglobiini A1C:stä, lääkkeistä ja insuliinihoidosta osallistujien lääketieteellisistä kartoista.

Syntymätiedot ja näytteenotto synnytyksen yhteydessä: Osallistujat ilmoittavat puhelimitse tutkijoille saapumisestaan ​​synnytyskeskukseen. Tutkijat lähettävät heille myös muistutuksia eräpäivien lähestyessä. Lisäksi synnytyskeskuksen lääkintähenkilöstölle annetaan luettelo osallistujien nimistä, joten he ovat myös yhteydessä tutkijoihin, jos osallistuja kirjautuu sisään, kun kukaan tutkimushenkilöstöstä ei ole paikalla. Kun vauva on syntynyt, tutkijat keräävät kaksi napanuoraveren putkea seerumin, plasman ja keuhkoturkin hakemiseksi. Tutkijat mittaavat istukan koon ja painon ja käsittelevät istukan seuraavalla menetelmällä: täyspaksuiset istukan biopsiat otetaan käyttämällä 6 mm:n Keyes-lävistystä ja stabiloidaan RNAlater®:ssä (RNA:lle) tai jäädytetään nestetypessä. (muihin tarkoituksiin). Näytteet kuljetetaan rinnakkaistutkijan laboratorioon pitkäaikaista säilytystä varten -80 C:ssa ennen käyttöä.

Ruokavalion saannin arviointi: Kuten edellä mainittiin, NDSR-ohjelmisto analysoi 3 päivän ruokavaliosta kerätyt tiedot. Kokonaiskoliinin päivittäinen saanti lasketaan kertomalla kulutustiheys koliinijohdannaisten summalla, mukaan lukien vapaa koliini, fosfatidyylikoliini (PC), glyserofosfokoliini (GPC), fosfokoliini ja sfingomyeliini kussakin elintarvikkeessa. Betaiinin (koliinin hapettumistuotteen) päivittäinen saanti lasketaan kertomalla kunkin ruuan kulutustiheys ja betaiinipitoisuus. Keskimääräinen päivittäinen saanti lasketaan keskimääräisenä päivittäisenä kokonaiskoliinin ja betaiinin kulutuksena kolmen päivän aikana, kun ruokavalio on palautettu.

Koliinin metaboliittien mittaukset: vapaa koliini, betaiini ja muut koliinijohdannaiset [esim. PC, GPC, lysofosfatidyylikoliini, dimetyyliglysiini, trimetyyliamiinioksidi (TMAO)] mitataan äidin plasmassa käyttämällä nestekromatografiaa (LC)-massaspektrometriaa (MS) /MS, kuten aiemmissa tutkimuksissa tehtiin. Tietojen tarkkuuden ja toistettavuuden varmistamiseksi uuttamisessa käytetään stabiileja isotooppileimattuja standardeja, kaikki näytteet kvantifioidaan 6 pisteen standardikäyrän perusteella ja jokainen näyte ajetaan kahtena kappaleena. Näytteet, joiden variaatiokerroin (CV) % on suurempi kuin 5 % ajon aikana tai 10 % ajon välillä, ajetaan uudelleen.

Erityinen tavoite 2: Määritä MCS:n vaikutus makroravinteiden kuljetukseen ja epigeneettisiin modifikaatioihin istukassa ja napanuoraveressä. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi tutkijat määrittävät osallistujien istukan biopsioissa rasvan ja glukoosin kuljettajien ilmentymisen sekä ylävirran AKT/mTOR-säätelyreitit. Tutkijat mittaavat istukan ja napanuoraveren kasvuun ja aineenvaihduntaan liittyvien keskeisten geenien paikkaspesifistä DNA-metylaatiota.

Makroravinteiden kuljetusmarkkerien analyysit istukan biopsioissa: Analysoidakseen, kuinka koliinin aineenvaihdunta voi liittyä istukan rasvan ja glukoosin kuljetukseen, tutkijat käyttävät reaaliaikaista PCR:ää rasva- ja glukoosiaineenvaihduntageenien ja -kuljettajien, kuten glukoosinkuljettajien GLUT1, mRNA:n määrän määrittämiseen. ja GLUT3, rasvahappometaboliaan liittyvät geenit lipoproteiinilipaasi (LPL), rasvahappotranslokaasi (CD36), FATP:t ja aminohappokuljettajat SNAT2 ja SNAT4. Vastaavien proteiinien runsaus sekä AKT- ja mTOR-kohteiden 4EBP1 ja S6K fosforylaatio (osoittaa reitin aktivaatiosta) mitataan myös Western blot -testillä, joka suoritetaan rutiininomaisesti yhteistutkijan laboratoriossa, joka sisältää SDS-PAGE:n. kalvonsiirto, inkubointi vasta-aineiden kanssa ja visualisointi kemiluminesenssikuvausjärjestelmällä. Kaikki alukkeen tehokkuus ja vasta-aineiden laatu testataan ennen käyttöä. Sekä reaaliaikainen PCR että Western blot ajetaan kolmena rinnakkaisena.

Kasvun ja aineenvaihdunnan epigeneettinen säätely: tutkijat tutkivat aiemmissa tutkimuksissa julkaistujen geenien paikkaspesifistä DNA-metylaatiota, jotka ovat alttiita synnytystä edeltävälle altistukselle ja jotka välittävät jälkeläisten pitkän aikavälin kasvua ja metabolista ohjelmointia käyttämällä bisulfiittisekvensointia, kuten aiemmin tehtiin. . Lyhyesti sanottuna genominen DNA käsitellään bisulfiittireagenssilla, minkä jälkeen kohdegenominen alue monistetaan PCR:llä. MassArray EpiTyper -järjestelmää käytetään metyloituneiden sekvenssien kvantifiointiin. Kiinnostavia geenejä ovat LEP, SREBP1C ja PPARG, jotka välittävät rasva-aineenvaihduntaa, IGF2, joka edistää kasvua, kortikotropiinia vapauttava hormoni (CRH), joka edistää kortisolin eritystä, ja glukokortikoidireseptori (GR), joka vastaanottaa kortisolisignaaleja.