Choline-suppletie op foetale groei bij zwangerschapsdiabetes mellitus

STUDIEDOELSTELLINGEN Specifiek doel 1: Vaststellen van het effect van MCS tijdens de zwangerschap op het geboortegewicht bij GDM.

Specifiek doel 2: Bepaling van de invloed van MCS op het transport van macronutriënten en epigenetische modificaties in de placenta en het navelstrengbloed.

HYPOTHESE

Doel 1: De onderzoekers veronderstellen dat de cholinegroep een lager geboortegewicht en minder LGA-pasgeborenen zou hebben dan de niet-cholinegroep.

Doel 2: De onderzoekers veronderstellen dat de cholinegroep het transport van de placenta zou verminderen en de DNA-methylatie van metabolische genen zou verhogen.

STUDIE ONTWERP

Onderwerpen: Er zal een handige bemonsteringsmethode worden toegepast. De onderzoekers zullen tijdens het tweede trimester van de zwangerschap op voortschrijdende basis zwangere vrouwen rekruteren met de diagnose GDM. Blokrandomisatie zal worden uitgevoerd op basis van behandelmethoden (d.w.z. insulinetherapie, orale bloedglucoseverlagende middelen of alleen dieet) om deelnemers willekeurig toe te wijzen aan de interventie- en controlegroepen. Werving zal worden uitgevoerd met behulp van de volgende methoden: (i) studiefolders zullen worden gepost in de prenatale kliniek; (ii) de onderzoekers identificeren zwangere vrouwen die mogelijk in aanmerking komen door medische dossiers te bekijken.

Geschiktheidscriteria: De inclusiecriteria omvatten GDM-zwangere vrouwen vóór zwangerschapsweek 28. GDM wordt gediagnosticeerd met het 2-stapsproces: bloedglucose hoger dan de 140 mg/dL afkapwaarde na 50 g niet-nuchtere 1 uur en 100 g 3 uur orale glucoseprovocaties. Zwangere vrouwen komen in aanmerking om deel te nemen als ze Engels- of Spaanssprekend zijn, ouder zijn dan 18 jaar, een eenlingzwangerschap hebben, van plan zijn hun baby's in de instelling ter wereld te brengen en niet voldoen aan een van de voorwaarden vermeld in de uitsluitingscriteria. Uitsluitingscriteria zijn onder meer reeds bestaande hyperglykemie, diabetes, cardiovasculaire aandoeningen en leverziekte voorafgaand aan de zwangerschap. Patiënten kunnen ervoor kiezen om deel te nemen aan de studie en geen biopsie van hun placenta of navelstreng te doneren. Patiënten die stamceldonatie of -opslag wensen, kunnen geen biopsie van hun placenta of navelstreng doneren. Deze patiënten worden niet uitgesloten van de primaire analyse.

Procedures voor ontwerp en gegevensverzameling:

Alle interactie met deelnemers vindt plaats in het leverende ziekenhuis, terwijl monsteranalyses plaatsvinden op het College waar het laboratorium van de mede-onderzoeker is gevestigd. De coördinator voor de studie, in dienst van de mede-onderzoekers (Brooklyn College), zal geen gegevens op afstand openen of opslaan en alle gegevensverzameling en -analyse zullen plaatsvinden op de campus van het ziekenhuis.

De onderzoekers zullen schriftelijke geïnformeerde toestemming van de zwangere vrouwen verkrijgen voordat ze aan de studie deelnemen. Randomisatie zal worden gedaan door de apotheek nadat de patiënt toestemming heeft gegeven. Het zal een blokrandomisatie zijn van 6 patiënten. Na randomisatie geven de onderzoekers de deelnemer aan de interventiegroep cholinesupplementpillen met 500 mg cholinebitartraat (235 mg choline, Douglas Lab). De deelnemer consumeert 2 pillen per dag om 470 mg choline binnen te krijgen gedurende 8 weken. De aanbevolen inname van choline in de vorm van Adequate Intake (AI) is 450 mg/d voor zwangere vrouwen en de Tolerable Upper Intake Level (UL) is 3500 mg/d. Aangezien minder dan 10% zwangere vrouwen de AI van de choline-inname bereiken en het bovenste kwartiel van de choline-inname lager is dan 900 mg/d. De dosering die de onderzoekers geven plus de gebruikelijke inname van choline bij deze zwangere vrouwen zal tussen de AI en UL vallen, d.w.z. voldoende maar niet boven de limiet. De deelnemers in de controlegroep krijgen een placebo. Beide groepen krijgen ook standaard prenatale multivitaminen. De onderzoekers zullen de deelnemers een voorraad supplementen voor 5 weken geven en de onderzoekers zullen tijdens hun volgende bezoek hun naleving gedurende de tijd verifiëren met dagelijkse afvinklogboeken van het supplementverbruik en het aantal overgebleven pillen.

De deelnemers komen voor een totaal van 3 bezoeken in tijden van routinematige klinische zorg. Het eerste bezoek zal tussen 24 en 28 weken zwangerschap zijn wanneer de onderzoekers de deelnemers inschrijven, het tweede bezoek zal tussen 28 en 32 weken zwangerschap zijn en het derde bezoek zal tussen 32 en 36 weken zijn. De onderzoekers verzamelen een basisvragenlijst bij het eerste bezoek (ongeveer 20 minuten), voeren driedaagse dieetherinneringen uit na het eerste bezoek (ongeveer 20 minuten, elk), controleren het huidige gewicht en verzamelen bij alle bezoeken 20 ml bloedmonsters. Bij aflevering verzamelen de onderzoekers placentamonsters en navelstrengbloed van de deelnemers.

Basislijnvragenlijst: De vragenlijst bevat demografische en medische informatie zoals leeftijd, uitgerekende datum, etniciteit, pariteit, burgerlijke staat, opleidingsniveau, beroep, gezinsinkomen, medische verzekering, middelengebruik, medicijngebruik, voedingssupplementen, familiegeschiedenis van chronische ziekten, en zelfgerapporteerd gewicht vóór de zwangerschap.

Dieetbeoordeling: Drie 24-uurs dieetherinneringen, 2 op weekdagen en 1 op een weekenddag, zullen van elke deelnemer worden verkregen door een getrainde onderzoeksassistent (RA) via telefoontjes na de eerste bezoeken om de inname van choline via de voeding te kwantificeren. De multi-pass-methode van Harnack en collega's zal worden gebruikt. De RA registreert voedselidentificatie, hoeveelheid, ingrediëntspecificatie, bereidingsmethode en voert gegevens in de Nutrition Data System for Research (NDSR) -software in om de choline-inname te analyseren. De RA zal deelnemers ook vragen naar hun fysieke activiteit (PA) gedurende de afgelopen 24 uur met behulp van het PA-terugroepinstrument.

Antropometrische metingen en bloedafname: de onderzoekers meten tijdens de bezoeken het gewicht en de lengte van de deelnemers met behulp van een medische weegschaal met mechanische hoogtestaven. Om voedselgerelateerde concentratieverschillen in plasma-biomarkers te minimaliseren, krijgen deelnemers de instructie om gedurende ten minste 4 uur voor hun bloedafname in de ochtend geen voedsel te consumeren. Dit is een standaardaanbeveling voor prenatale bezoeken en wordt als veilig beschouwd. Ongeveer 20 ml nuchter veneus bloed zal tijdens de bezoeken door een onderzoeker bij elke deelnemer worden afgenomen. Bloedmonsters worden verzameld in één EDTA-bloedafnamebuis en één serumscheidingsbuis en gecentrifugeerd om plasma, buffy coat en serum te verkrijgen. Monsters worden verwerkt en opgeslagen bij -80oC in het laboratorium totdat ze worden gebruikt voor analytische metingen.

Bloedglucosemanagement: De onderzoekers halen informatie over nuchtere glucose, hemoglobine A1C, medicatie en insulinetherapie uit medische dossiers van de deelnemers.

Geboortegegevens en monsterafname bij aflevering: De deelnemers verwittigen de onderzoekers bij opname in het geboortecentrum telefonisch. De rechercheurs zullen hen ook herinneringen sturen als hun uitgerekende datum nadert. Bovendien krijgt de medische staf van het geboortecentrum een ​​lijst met namen van de deelnemers, zodat zij ook contact opnemen met de onderzoekers als een deelnemer incheckt terwijl er geen van de onderzoeksmedewerkers ter plaatse is. Zodra de baby is afgeleverd, verzamelen de onderzoekers twee buisjes navelstrengbloed om serum, plasma en buffy coat op te halen. De onderzoekers zullen de grootte en het gewicht van de placenta meten en de placenta verwerken met behulp van de volgende methode: biopten van de placenta van volledige dikte worden verkregen met behulp van een 6 mm Keyes-pons en gestabiliseerd in RNAlater® (voor RNA), of ingevroren in vloeibare stikstof (voor andere doeleinden). Monsters worden voor gebruik naar het laboratorium van de mede-onderzoeker vervoerd voor langdurige opslag bij -80C.

Beoordeling van de inname via de voeding: zoals hierboven vermeld, worden gegevens over de inname via de voeding die zijn verzameld uit 3-daagse terugroepacties, geanalyseerd door de NDSR-software. De dagelijkse inname van totale choline wordt berekend door de consumptiefrequentie te vermenigvuldigen met de som van de cholinederivaten, inclusief vrije choline, fosfatidylcholine (PC), glycerofosfocholine (GPC), fosfocholine en sfingomyeline van elk voedingsmiddel. De dagelijkse inname van betaïne (het oxidatieproduct van choline) wordt berekend door de consumptiefrequentie en het betaïnegehalte van elk voedingsmiddel te vermenigvuldigen. De gemiddelde dagelijkse inname wordt berekend als de gemiddelde dagelijkse consumptie van totale choline en betaïne gedurende de 3 dagen van terugroepacties.

Metingen van cholinemetabolieten: vrij choline, betaïne en andere cholinederivaten [bijv. PC, GPC, lysofosfatidylcholine, dimethylglycine, trimethylamineoxide (TMAO)] zullen worden gemeten in maternale plasma met behulp van vloeistofchromatografie (LC)-massaspectrometrie (MS)/MS zoals werd uitgevoerd in eerdere studies. Om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de gegevens te garanderen, zullen bij de extractie stabiele isotoopgelabelde standaarden worden gebruikt, zullen alle monsters worden gekwantificeerd op basis van een 6-punts standaardcurve en zal elk monster in tweevoud worden uitgevoerd. Monsters met een variatiecoëfficiënt (CV) % hoger dan 5% binnen de run of 10% tussen de runs zullen opnieuw worden uitgevoerd.

Specifiek doel 2: Bepaling van de invloed van MCS op het transport van macronutriënten en epigenetische modificaties in de placenta en het navelstrengbloed. Om dit doel te bereiken, zullen de onderzoekers de expressie van vet- en glucosetransporters bepalen, evenals de stroomopwaartse regulerende routes AKT/mTOR in placentabiopten van de deelnemers. De onderzoekers zullen de locatiespecifieke DNA-methylering van belangrijke groei- en metabolismegerelateerde genen in de placenta en het navelstrengbloed meten.

Analyses van transportmarkers van macronutriënten in placentabiopten: om te analyseren hoe het cholinemetabolisme gerelateerd kan zijn aan vet- en glucosetransport in de placenta, zullen de onderzoekers real-time PCR gebruiken om de mRNA-abundantie van vet- en glucosemetabolische genen en transporters, zoals glucosetransporters GLUT1, te kwantificeren. en GLUT3, vetzuurmetabolisme-gerelateerde genen lipoproteïne lipase (LPL), vetzuurtranslocase (CD36), FATP's en aminozuurtransporters SNAT2 en SNAT4. Overvloed aan respectieve eiwitten, evenals fosforylering van AKT, en mTOR-doelen 4EBP1 en S6K (indicatief voor activering van de route) zullen ook worden gemeten door western blotting die routinematig wordt uitgevoerd in het laboratorium van de co-onderzoeker, waaronder SDS-PAGE, membraanoverdracht, incubatie met antilichamen en visualisatie met een chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. Alle primerefficiëntie en antilichaamkwaliteit worden getest voordat ze worden gebruikt. Zowel real-time PCR als western blot zullen in drievoud worden uitgevoerd.

Epigenetische regulatie van groei en metabolisme: de onderzoekers zullen plaatsspecifieke DNA-methylatie onderzoeken van genen waarvan in eerdere studies is gepubliceerd dat ze vatbaar zijn voor prenatale blootstelling en dat ze langdurige groei en metabolische programmering van het nageslacht bemiddelen met behulp van bi-sulfiet-sequencing zoals eerder werd uitgevoerd . In het kort, genomisch DNA zal worden behandeld met bisulfietreagens, waarna het genoomdoelgebied zal worden geamplificeerd door middel van PCR. Een MassArray EpiTyper-systeem zal worden gebruikt om gemethyleerde sequenties te kwantificeren. Interessante genen zijn onder meer LEP, SREBP1C en PPARG dat het vetmetabolisme bemiddelt, IGF2 dat de groei bevordert, corticotropine releasing hormoon (CRH) dat de secretie van cortisol bevordert, en glucocorticoïdreceptor (GR) dat cortisolsignalen ontvangt.