Suplementacja choliny na wzrost płodu w cukrzycy ciążowej

CELE BADANIA Cel szczegółowy 1: Określenie wpływu MCS w czasie ciąży na masę urodzeniową w przypadku GDM.

Cel szczegółowy 2: Określenie wpływu MCS na transport makroskładników odżywczych i modyfikacje epigenetyczne w łożysku i krwi pępowinowej.

HIPOTEZA

Cel 1: Badacze postawili hipotezę, że grupa cholinowa miałaby niższą wagę urodzeniową i mniej noworodków LGA niż grupa bez choliny.

Cel 2: Badacze stawiają hipotezę, że grupa cholinowa zmniejszy transport łożyskowy i zwiększy metylację DNA genów metabolicznych.

PROJEKT BADANIA

Tematy: Przyjęta zostanie dogodna metodologia doboru próby. Badacze będą rekrutować kobiety w ciąży, u których zdiagnozowano GDM w drugim trymestrze ciąży, w sposób ciągły. Randomizacja blokowa będzie prowadzona w oparciu o metody leczenia (tj. insulinoterapię, doustne leki hipoglikemizujące lub samą dietę), aby losowo przypisać uczestników do grup interwencyjnych i kontrolnych. Rekrutacja zostanie przeprowadzona przy użyciu następujących metod: (i) ulotki badawcze zostaną wywieszone w poradni prenatalnej; (ii) badacze zidentyfikują kobiety w ciąży, które potencjalnie kwalifikują się, przeglądając dokumentację medyczną.

Kryteria kwalifikacji: Kryteria włączenia obejmują kobiety w ciąży z GDM przed 28. tygodniem ciąży. GDM diagnozuje się w procesie dwuetapowym: poziom glukozy we krwi wyższy niż wartość odcięcia 140 mg/dl po 50 g nie na czczo przez 1 godzinę i 100 g glukozy we krwi przez 3 godziny doustnie. Kobiety w ciąży kwalifikują się do udziału, jeśli mówią po angielsku lub hiszpańsku, mają ukończone 18 lat, są w ciąży pojedynczej, zamierzają urodzić dziecko w placówce i nie spełniają żadnych warunków wymienionych w kryteriach wykluczenia. Kryteria wykluczenia obejmują istniejącą wcześniej hiperglikemię, cukrzycę, choroby sercowo-naczyniowe i choroby wątroby przed ciążą. Pacjenci mogą zdecydować się na udział w badaniu i nie oddać biopsji łożyska lub pępowiny. Pacjenci, którzy chcą być dawcami lub przechowywać komórki macierzyste, nie będą mogli wykonać biopsji łożyska lub pępowiny. Pacjenci ci nie zostaną wykluczeni z analizy pierwotnej.

Procedury projektowania i gromadzenia danych:

Wszystkie interakcje z uczestnikami będą miały miejsce w szpitalu dostarczającym, podczas gdy analizy próbek będą miały miejsce w Kolegium, w którym znajduje się laboratorium współbadacza. Koordynator badania, zatrudniony przez współbadaczy (Brooklyn College), nie będzie uzyskiwał dostępu do danych ani ich przechowywał zdalnie, a wszelkie gromadzenie i analiza danych będą odbywać się na terenie kampusu szpitalnego.

Badacze uzyskają pisemną świadomą zgodę kobiet w ciąży przed przystąpieniem do badania. Randomizacja zostanie przeprowadzona przez aptekę po podpisaniu przez pacjenta zgody. Będzie to randomizacja blokowa 6 pacjentów. Po randomizacji badacze dostarczą uczestnikowi z grupy interwencyjnej pigułki uzupełniające cholinę zawierające 500 mg dwuwinianu choliny (235 mg choliny, Douglas Lab). Uczestnik będzie spożywał 2 tabletki dziennie, aby uzyskać 470 mg choliny na 8 tygodni. Zalecane spożycie choliny w postaci odpowiedniego spożycia (AI) wynosi 450 mg/d dla kobiet w ciąży, a tolerowany górny poziom spożycia (UL) to 3500 mg/d. Ponieważ mniej niż 10% kobiet w ciąży osiąga AI spożycia choliny, a górny kwartyl spożycia choliny wynosi poniżej 900 mg/d. Dawka podana przez badaczy plus zwykłe spożycie choliny u tych kobiet w ciąży będzie mieścić się między AI a UL, tj. wystarczającą, ale nieprzekraczającą limitu. Uczestnicy z grupy kontrolnej otrzymają placebo. Obie grupy otrzymają również standardowe prenatalne multiwitaminy. Badacze zapewnią uczestnikom zapas suplementów na 5 tygodni, a badacze zweryfikują ich przestrzeganie w tym czasie z codziennymi dziennikami kontrolnymi spożycia suplementów i liczby pozostałych pigułek podczas następnej wizyty.

Uczestnicy przyjdą łącznie na 3 wizyty w ramach rutynowej opieki klinicznej. Pierwsza wizyta odbędzie się między 24 a 28 tygodniem ciąży, kiedy badacze zapiszą uczestników, druga wizyta między 28 a 32 tygodniem ciąży, a trzecia wizyta między 32 a 36 tygodniem. Badacze zbiorą kwestionariusz wyjściowy podczas pierwszej wizyty (około 20 minut), przeprowadzą 3-dniowe wywiady żywieniowe po pierwszej wizycie (każda po około 20 minut) oraz sprawdzą aktualną wagę i pobiorą 20 ml próbek krwi podczas wszystkich wizyt. Podczas porodu badacze pobiorą próbki łożyska i krwi pępowinowej od uczestników.

Kwestionariusz podstawowy: Kwestionariusz zawiera informacje demograficzne i medyczne, takie jak wiek, data porodu, pochodzenie etniczne, liczba par, stan cywilny, poziom wykształcenia, zawód, dochód gospodarstwa domowego, ubezpieczenie medyczne, używanie substancji psychoaktywnych, przyjmowanie leków, suplement diety, historia chorób przewlekłych w rodzinie, i samozgłoszoną wagę przed ciążą.

Ocena diety: Trzy 24-godzinne przypomnienia dietetyczne, 2 w dni powszednie i 1 w weekend, zostaną uzyskane od każdego uczestnika przez wyszkolonego asystenta badawczego (RA) za pośrednictwem rozmów telefonicznych po pierwszych wizytach w celu ilościowego określenia spożycia choliny w diecie. Wykorzystana zostanie metoda wieloprzebiegowa Harnacka i współpracowników. RA będzie rejestrować identyfikację żywności, ilość, specyfikację składników, metodę przygotowania i wprowadzać dane do oprogramowania Nutrition Data System for Research (NDSR) w celu analizy spożycia choliny. RA zapyta również uczestników o ich aktywność fizyczną (PA) w ciągu ostatnich 24 godzin za pomocą przyrządu przypominającego PA.

Pomiary antropometryczne i pobieranie krwi: Podczas wizyt badacze będą mierzyć wagę i wzrost uczestników za pomocą wagi medycznej z mechanicznymi prętami wzrostu. Aby zminimalizować związane z pożywieniem różnice stężeń biomarkerów w osoczu, uczestnicy zostaną poinstruowani, aby nie spożywali pokarmu przez co najmniej 4 godziny przed porannym pobraniem krwi. Jest to standardowe zalecenie dla wizyt prenatalnych i jest uważane za bezpieczne. Podczas wizyt badacza od każdego uczestnika zostanie pobrane około 20 ml krwi żylnej na czczo. Próbki krwi zostaną pobrane do jednej probówki do pobierania krwi EDTA i jednej probówki do oddzielania surowicy i odwirowane w celu uzyskania osocza, kożuszka leukocytarnego i surowicy. Próbki będą przetwarzane i przechowywane w laboratorium w temperaturze -80oC do czasu wykorzystania ich do pomiarów analitycznych.

Zarządzanie glikemią: Badacze uzyskają informacje na temat glukozy na czczo, hemoglobiny A1C, leków i insulinoterapii z kart medycznych uczestników.

Informacje o narodzinach i pobieranie próbek przy porodzie: Uczestnicy powiadomią badaczy telefonicznie o przyjęciu do centrum narodzin. Śledczy będą im również wysyłać przypomnienia, gdy zbliżają się terminy. Ponadto personel medyczny centrum narodzin otrzyma listę nazwisk uczestników, w związku z czym skontaktuje się również z badaczami, jeśli uczestnik zgłosi się, gdy nikogo z personelu badawczego nie ma na miejscu. Po urodzeniu dziecka badacze pobiorą dwie probówki krwi pępowinowej, aby pobrać surowicę, osocze i kożuszek leukocytarny. Badacze zmierzą rozmiar i wagę łożyska i przetworzą łożysko, stosując następującą metodę: biopsje łożyska pełnej grubości zostaną uzyskane za pomocą 6-milimetrowego stempla Keyesa i ustabilizowane w RNAlater® (dla RNA) lub zamrożone w ciekłym azocie (do innych celów). Próbki zostaną przetransportowane do laboratorium współbadacza w celu długoterminowego przechowywania w temperaturze -80°C przed użyciem.

Ocena spożycia: Jak wspomniano powyżej, dane dotyczące spożycia zebrane z 3-dniowych wywiadów żywieniowych zostaną przeanalizowane przez oprogramowanie NDSR. Dzienne spożycie całkowitej choliny zostanie obliczone poprzez pomnożenie częstotliwości spożycia przez sumę pochodnych choliny, w tym wolnej choliny, fosfatydylocholiny (PC), glicerofosfocholiny (GPC), fosfocholiny i sfingomieliny każdego produktu spożywczego. Dzienne spożycie betainy (produkt utleniania choliny) zostanie obliczone poprzez pomnożenie częstotliwości spożycia i zawartości betainy w każdym pożywieniu. Średnie dzienne spożycie zostanie obliczone jako średnie dzienne spożycie całkowitej choliny i betainy w ciągu 3 dni wycofania diety.

Pomiary metabolitów choliny: wolnej choliny, betainy i innych pochodnych choliny [np. PC, GPC, lizofosfatydylocholina, dimetyloglicyna, tlenek trimetyloaminy (TMAO)] będą mierzone w osoczu matki za pomocą chromatografii cieczowej (LC)-spektrometrii masowej (MS)/MS, jak przeprowadzono w poprzednich badaniach. Aby zapewnić dokładność i odtwarzalność danych, podczas ekstrakcji stosowane będą standardy oznaczane stabilnymi izotopami, wszystkie próbki będą oznaczane ilościowo na podstawie 6-punktowej krzywej wzorcowej, a każda próbka będzie analizowana w dwóch powtórzeniach. Próbki o współczynniku zmienności (CV) % wyższym niż 5% w obrębie serii lub 10% pomiędzy seriami zostaną ponownie przebadane.

Cel szczegółowy 2: Określenie wpływu MCS na transport makroskładników odżywczych i modyfikacje epigenetyczne w łożysku i krwi pępowinowej. Aby osiągnąć ten cel, badacze określą ekspresję transporterów tłuszczu i glukozy, a także górne szlaki regulacyjne AKT/mTOR w biopsjach łożyska od uczestników. Badacze zmierzą specyficzną dla miejsca metylację DNA kluczowych genów związanych ze wzrostem i metabolizmem w łożysku i krwi pępowinowej.

Analizy markerów transportu makroskładników odżywczych w biopsjach łożyska: Aby przeanalizować, w jaki sposób metabolizm choliny może być powiązany z transportem tłuszczu łożyskowego i glukozy, badacze wykorzystają PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego określenia ilości mRNA genów i transporterów metabolicznych tłuszczu i glukozy, takich jak transportery glukozy GLUT1 i GLUT3, geny związane z metabolizmem kwasów tłuszczowych lipaza lipoproteinowa (LPL), translokaza kwasów tłuszczowych (CD36), FATP i transportery aminokwasów SNAT2 i SNAT4. Obfitość odpowiednich białek, a także fosforylacja AKT i docelowych mTOR 4EBP1 i S6K (wskazujących na aktywację szlaku) będzie również mierzona za pomocą western blotting, który jest rutynowo przeprowadzany w laboratorium współbadacza, który obejmuje SDS-PAGE, transfer membranowy, inkubacja z przeciwciałami i wizualizacja za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Cała skuteczność starterów i jakość przeciwciał zostaną przetestowane przed użyciem. Zarówno PCR w czasie rzeczywistym, jak i Western blot będą przeprowadzane w trzech powtórzeniach.

Epigenetyczna regulacja wzrostu i metabolizmu: badacze zbadają specyficzną dla miejsca metylację DNA genów, które zostały opublikowane w poprzednich badaniach jako podatne na ekspozycje prenatalne i pośredniczą w długotrwałym wzroście i programowaniu metabolicznym potomstwa przy użyciu sekwencjonowania wodorosiarczynem, jak to było wcześniej przeprowadzone . W skrócie, genomowy DNA będzie traktowany odczynnikiem wodorosiarczynowym, po czym docelowy region genomowy będzie amplifikowany przez PCR. System MassArray EpiTyper zostanie wykorzystany do ilościowego określenia sekwencji metylowanych. Geny będące przedmiotem zainteresowania obejmują LEP, SREBP1C i PPARG, które pośredniczą w metabolizmie tłuszczów, IGF2, który promuje wzrost, hormon uwalniający kortykotropinę (CRH), który promuje wydzielanie kortyzolu, oraz receptor glukokortykoidowy (GR), który odbiera sygnały kortyzolu.