补充胆碱对妊娠糖尿病胎儿生长的影响

研究目标 具体目标 1：确定妊娠期 MCS 对 GDM 出生体重的影响。

具体目标 2：确定 MCS 对胎盘和脐带血中常量营养素转运和表观遗传修饰的影响。

假设

目标 1：研究人员假设胆碱组的出生体重和 LGA 新生儿比非胆碱组低。

目标 2：研究人员假设胆碱组会减少胎盘转运并增加代谢基因的 DNA 甲基化。

学习规划

受试者：将采用方便的抽样方法。 研究人员将滚动招募在妊娠中期诊断为 GDM 的孕妇。 将根据治疗方法（即 胰岛素治疗、口服降糖药或仅饮食）将参与者随机分配到干预组和对照组。 招募将使用以下方法进行：(i) 研究传单将张贴在产前诊所； (ii) 研究人员将通过审查病历确定可能符合条件的孕妇。

资格标准：纳入标准包括妊娠 28 周前的 GDM 孕妇。 GDM 被诊断为两步过程：在 50 g 非空腹 1 小时和 100 g 3 小时口服葡萄糖挑战后，血糖高于 140 mg/dL 的临界值。 如果孕妇说英语或西班牙语，年满 18 岁，单胎妊娠，打算在机构分娩并且没有排除标准中列出的任何条件，则有资格参加。 排除标准包括怀孕前已存在的高血糖症、糖尿病、心血管疾病和肝病。 患者可以选择参加研究，而不是捐献胎盘或脐带的活组织检查。 希望捐赠或储存干细胞的患者将无法捐赠其胎盘或脐带的活组织检查。 这些患者不会被排除在主要分析之外。

设计和数据收集程序：

与参与者的所有互动都将在分娩医院进行，而样本分析将在合作研究者实验室所在的学院进行。 该研究的协调员由联合调查员（布鲁克林学院）聘用，不会远程访问或存储数据，所有数据收集和分析都将在医院校园内进行。

研究人员将在进入研究前获得孕妇的书面知情同意书。 在患者签署同意书后，药房将进行随机化。 这将是 6 名患者的块随机化。 随机分组后，研究人员将为干预组的参与者提供胆碱补充药丸，其中含有 500 毫克酒石酸氢胆碱（235 毫克胆碱，道格拉斯实验室）。 参与者将每天服用 2 粒药丸以获得 470 毫克的胆碱，持续 8 周。 孕妇胆碱的推荐摄入量（AI）为 450 mg/d，可耐受摄入量上限（UL）为 3500 mg/d。 由于只有不到 10% 的孕妇达到了胆碱摄入量的 AI，胆碱摄入量的上四分位数低于 900 mg/d。 研究者提供的剂量加上这些孕妇胆碱的习惯摄入量会落在 AI 和 UL 之间，即足够但不超过限度。 对照组的参与者将接受安慰剂。 两组还将接受标准的产前复合维生素。 调查人员将向参与者提供 5 周的补充剂供应，调查人员将在下次访问期间通过每天检查补充剂消耗量和剩余药片数量的日志来验证他们的依从性。

参与者将在常规临床护理时总共进行 3 次访问。 当研究人员招募参与者时，第一次访视将在妊娠 24 至 28 周之间进行，第二次访视将在妊娠 28 至 32 周之间进行，第三次访视将在妊娠 32 至 36 周之间进行。 调查人员将在第一次访问时（大约 20 分钟）收集基线问卷，在第一次访问后进行为期 3 天的饮食回顾（每次大约 20 分钟），并检查当前体重并在所有访问中收集 20 mL 血液样本。 分娩时，研究人员将从参与者那里收集胎盘样本和脐带血。

基线问卷：问卷包括年龄、预产期、种族、胎次、婚姻状况、教育程度、职业、家庭收入、医疗保险、物质使用、药物使用、营养补充、慢性病家族史等人口学和医疗信息，和自我报告的孕前体重。

饮食评估：三个 24 小时饮食回忆，工作日 2 个，周末 1 个，将由训练有素的研究助理 (RA) 通过电话从每位参与者处获得，以量化膳食胆碱摄入量。 将使用 Harnack 及其同事的多遍方法。 RA 将记录食品标识、数量、成分规格、制备方法并将数据输入研究营养数据系统 (NDSR) 软件以分析胆碱摄入量。 RA 还将使用 PA 回忆工具询问参与者过去 24 小时内的身体活动 (PA)。

人体测量和血液采集：调查人员将在访问期间使用带有机械身高杆的医疗体重秤测量参与者的体重和身高。 为了尽量减少与食物相关的血浆生物标志物浓度差异，将指导参与者在早上抽血前至少 4 小时内不要进食。 这是产前检查的标准建议，被认为是安全的。 在调查员访问期间，将从每位参与者抽取约 20 mL 的空腹静脉血。 将血液样本采集到一根EDTA采血管和一根血清分离管中，离心分离得到血浆、血沉棕黄层和血清。 样品将在-80oC 下在实验室进行处理和储存，直到用于分析测量。

血糖管理：研究人员将从参与者的病历中获取有关空腹血糖、血红蛋白 A1C、药物治疗和胰岛素治疗的信息。

分娩时的出生信息和样本采集：参与者在入院时通过电话通知调查人员。 随着截止日期的临近，调查人员还会向他们发送提醒。 此外，出生中心的医务人员将获得参与者姓名列表，因此如果参与者在没有研究人员在场时登记入住，他们也会联系调查人员。 婴儿出生后，研究人员将收集两管脐带血以提取血清、血浆和血沉棕黄层。 研究人员将测量胎盘的大小和重量，并使用以下方法处理胎盘：使用 6 毫米凯斯穿孔器获得全层胎盘活检，并在 RNAlater®（用于 RNA）中稳定，或在液氮中冷冻（用于其他目的）。 样品将被运送到合作研究者的实验室，在使用前在-80C 下长期储存。

膳食摄入量评估：如上所述，NDSR 软件将分析从 3 天膳食回顾中收集的膳食摄入量数据。 每日总胆碱摄入量的计算方法是将食用频率乘以胆碱衍生物的总和，包括游离胆碱、磷脂酰胆碱 (PC)、甘油磷酸胆碱 (GPC)、磷酸胆碱和每种食物的鞘磷脂。 甜菜碱（胆碱的氧化产物）的每日摄入量将通过将每种食物的食用频率乘以甜菜碱含量来计算。 平均每日摄入量将计算为 3 天饮食回顾期间总胆碱和甜菜碱的平均每日摄入量。

胆碱代谢物的测量：游离胆碱、甜菜碱和其他胆碱衍生物[例如 PC、GPC、溶血磷脂酰胆碱、二甲基甘氨酸、氧化三甲胺 (TMAO)] 将使用液相色谱 (LC)-质谱 (MS) /MS 在母体血浆中进行测量，如先前研究中所进行的那样。 为确保数据的准确性和可重复性，提取时将使用稳定同位素标记的标准品，所有样品将根据6点标准曲线进行定量，每个样品将进行双份运行。 运行内变异系数 (CV) % 高于 5% 或运行间变异系数 (CV) % 高于 10% 的样品将重新运行。

具体目标 2：确定 MCS 对胎盘和脐带血中常量营养素转运和表观遗传修饰的影响。 为实现这一目标，研究人员将确定脂肪和葡萄糖转运蛋白的表达，以及参与者胎盘活检中的上游调节通路 AKT/mTOR。 研究人员将测量胎盘和脐带血中关键生长和代谢相关基因的位点特异性 DNA 甲基化。

胎盘活检中常量营养素转运标记物分析：为了分析胆碱代谢如何与胎盘脂肪和葡萄糖转运相关，研究人员将使用实时 PCR 来量化脂肪和葡萄糖代谢基因和转运蛋白（例如葡萄糖转运蛋白 GLUT1）的 mRNA 丰度和 GLUT3、脂肪酸代谢相关基因脂蛋白脂肪酶 (LPL)、脂肪酸转位酶 (CD36)、FATP 和氨基酸转运蛋白 SNAT2 和 SNAT4。 各个蛋白质的丰度以及 AKT 的磷酸化和 mTOR 目标 4EBP1 和 S6K（指示通路的激活）也将通过共同研究者实验室常规进行的蛋白质印迹法测量，其中包括 SDS-PAGE，膜转移、抗体孵育和化学发光成像系统可视化。 所有引物效率和抗体质量将在使用前进行测试。 实时 PCR 和蛋白质印迹都将一式三份运行。

生长和代谢的表观遗传调控：研究人员将检查先前研究发表的基因的位点特异性 DNA 甲基化，这些基因易受产前暴露的影响，并使用亚硫酸氢盐测序介导后代的长期生长和代谢程序，如先前进行的那样. 简而言之，基因组 DNA 将用亚硫酸氢盐试剂处理，然后通过 PCR 扩增目标基因组区域。 MassArray EpiTyper 系统将用于量化甲基化序列。 感兴趣的基因包括介导脂肪代谢的 LEP、SREBP1C 和 PPARG、促进生长的 IGF2、促进皮质醇分泌的促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 和接收皮质醇信号的糖皮质激素受体 (GR)。