Добавка холина на рост плода при гестационном сахарном диабете

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ Конкретная цель 1: Определить влияние MCS во время беременности на массу тела при рождении при ГСД.

Конкретная цель 2: Определить влияние MCS на транспорт макронутриентов и эпигенетические модификации в плаценте и пуповинной крови.

ГИПОТЕЗА

Цель 1. Исследователи предполагают, что группа, получающая холин, будет иметь меньшую массу тела при рождении и меньше новорожденных с LGA, чем группа, не получающая холин.

Цель 2: Исследователи предполагают, что группа холина может уменьшить плацентарный транспорт и увеличить метилирование ДНК метаболических генов.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ

Субъекты: Будет принята удобная методология выборки. Исследователи будут набирать беременных женщин с диагнозом ГСД во втором триместре беременности на постоянной основе. Блочная рандомизация будет проводиться на основе методов лечения (т.е. только инсулинотерапия, пероральные гипогликемические препараты или диета), чтобы случайным образом распределить участников на экспериментальную и контрольную группы. Набор будет проводиться с использованием следующих методов: (i) листовки исследования будут расклеены в женской консультации; (ii) следователи выявят потенциально подходящих беременных женщин путем изучения медицинских записей.

Критерии приемлемости: критерии включения включают беременных женщин с ГСД до 28-й недели беременности. ГСД диагностируется с помощью двухэтапного процесса: уровень глюкозы в крови выше порогового значения 140 мг/дл после приема 50 г глюкозы без приема пищи в течение 1 часа и 100 г глюкозы в течение 3 часов перорально. Беременные женщины имеют право участвовать, если они говорят по-английски или по-испански, старше 18 лет, имеют одноплодную беременность, намерены рожать детей в учреждении и не имеют каких-либо заболеваний, перечисленных в критериях исключения. Критерии исключения включают ранее существовавшую гипергликемию, диабет, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания печени до беременности. Пациенты могут принять участие в исследовании и не сдавать биопсию своей плаценты или пуповины. Пациенты, которые желают пожертвовать или сохранить стволовые клетки, не смогут пожертвовать биопсию своей плаценты или пуповины. Эти пациенты не будут исключены из первичного анализа.

Процедуры проектирования и сбора данных:

Все взаимодействие с участниками будет происходить в родильном доме, а анализы образцов будут проводиться в Колледже, где находится лаборатория соисследователя. Координатор исследования, нанятый соисследователями (Бруклинский колледж), не будет получать доступ к данным или хранить их удаленно, и весь сбор и анализ данных будет происходить в кампусе больницы.

Перед включением в исследование исследователи получат письменное информированное согласие беременных женщин. Рандомизация будет проводиться аптекой после того, как пациент подпишет согласие. Это будет блочная рандомизация 6 пациентов. После рандомизации исследователи предоставят участнику группы вмешательства таблетки с добавкой холина, содержащие 500 мг битартрата холина (235 мг холина, Douglas Lab). Участник будет принимать по 2 таблетки в день, чтобы получить 470 мг холина в течение 8 недель. Рекомендуемое потребление холина в форме адекватного потребления (AI) составляет 450 мг / день для беременных женщин, а допустимый верхний уровень потребления (UL) составляет 3500 мг / день. Поскольку менее 10% беременных женщин достигают ИИ потребления холина, а верхний квартиль потребления холина составляет менее 900 мг/сутки. Дозировка, которую дают исследователи, плюс обычное потребление холина у этих беременных женщин будет находиться между AI и UL, то есть достаточной, но не превышающей предел. Участники контрольной группы получат плацебо. Обе группы также получат стандартные пренатальные поливитамины. Исследователи предоставят участникам 5-недельный запас добавок, и исследователи будут проверять их соблюдение в течение этого времени с ежедневными проверками журналов потребления добавок и количества оставшихся таблеток во время их следующего визита.

Участники придут в общей сложности на 3 визита во время обычного клинического ухода. Первый визит будет между 24 и 28 неделями беременности, когда исследователи зарегистрируют участников, второй визит будет между 28 и 32 неделями беременности, а третий визит будет между 32 и 36 неделями. Исследователи соберут исходный вопросник при первом посещении (примерно 20 минут), проведут 3-дневные обзоры диеты после первого посещения (примерно по 20 минут каждое), проверят текущий вес и соберут образцы крови по 20 мл во время всех посещений. При доставке исследователи соберут образцы плаценты и пуповинной крови у участников.

Базовый вопросник: Анкета включает демографические и медицинские данные, такие как возраст, дата родов, этническая принадлежность, паритет, семейное положение, уровень образования, профессия, доход семьи, медицинская страховка, употребление психоактивных веществ, прием лекарств, пищевые добавки, семейный анамнез хронических заболеваний, и самооценка веса до беременности.

Оценка диеты: три 24-часовых диетических отзыва, 2 в будние дни и 1 в выходной день, будут получены от каждого участника обученным научным сотрудником (RA) по телефону после первых посещений для количественной оценки потребления холина с пищей. Будет использован многопроходный метод Харнака и его коллег. RA будет записывать идентификацию пищевых продуктов, количество, спецификацию ингредиентов, метод приготовления и вводить данные в программное обеспечение системы данных о питании для исследований (NDSR) для анализа потребления холина. RA также спросит участников об их физической активности (PA) в течение последних 24 часов, используя инструмент отзыва PA.

Антропометрические измерения и забор крови. Во время посещений исследователи будут измерять вес и рост участников с помощью медицинских весов с механическими штангами для измерения высоты. Чтобы свести к минимуму различия в концентрации биомаркеров плазмы, связанные с пищей, участников проинструктируют не употреблять пищу как минимум за 4 часа до утреннего забора крови. Это стандартная рекомендация для пренатальных посещений, которая считается безопасной. Во время визитов исследователя у каждого участника будет взято около 20 мл венозной крови натощак. Образцы крови будут собираться в одну пробирку для сбора крови с ЭДТА и одну пробирку для отделения сыворотки и центрифугироваться для получения плазмы, лейкоцитарной пленки и сыворотки. Образцы будут обрабатываться и храниться при температуре -80°C в лаборатории, пока не будут использованы для аналитических измерений.

Управление уровнем глюкозы в крови: исследователи получат информацию о глюкозе натощак, гемоглобине A1C, лекарствах и инсулинотерапии из медицинских карт участников.

Информация о рождении и сбор образцов при родах: участники уведомят исследователей, когда их поместят в родильный центр по телефону. Следователи также будут отправлять им напоминания по мере приближения их сроков. Кроме того, медицинскому персоналу родильного дома будет предоставлен список имен участников, поэтому они также свяжутся с исследователями, если участник зарегистрируется, когда никого из исследовательского персонала нет на месте. После рождения ребенка исследователи берут две пробирки пуповинной крови, чтобы получить сыворотку, плазму и лейкоцитарную пленку. Исследователи измерят размер и вес плаценты и обработают плаценту, используя следующий метод: биоптаты плаценты на всю толщину будут получены с помощью 6-мм перфоратора Киза и стабилизированы в RNAlater® (для РНК) или заморожены в жидком азоте. (для других целей). Образцы будут доставлены в лабораторию соисследователя для длительного хранения при температуре -80°C перед использованием.

Оценка рациона питания: как упоминалось выше, данные о рационе питания, собранные из отзывов о рационе за 3 дня, будут проанализированы программным обеспечением NDSR. Ежедневное потребление общего холина будет рассчитываться путем умножения частоты потребления на сумму производных холина, включая свободный холин, фосфатидилхолин (ФХ), глицерофосфохолин (ГФХ), фосфохолин и сфингомиелин каждого пищевого продукта. Ежедневное потребление бетаина (продукта окисления холина) будет рассчитываться путем умножения частоты потребления и содержания бетаина в каждом продукте. Среднее суточное потребление будет рассчитываться как среднее суточное потребление общего холина и бетаина за 3 дня диетических отзывов.

Измерения метаболитов холина: свободный холин, бетаин и другие производные холина [например, ФХ, ГФХ, лизофосфатидилхолин, диметилглицин, оксид триметиламина (ТМАО)] будут измерять в материнской плазме с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ)-масс-спектрометрии (МС)/МС, как это проводилось в предыдущих исследованиях. Для обеспечения точности и воспроизводимости данных при экстракции будут использоваться стандарты, меченные стабильными изотопами, все образцы будут количественно оценены на основе стандартной кривой с 6 точками, и каждый образец будет проанализирован в двух экземплярах. Образцы с коэффициентом вариации (CV) % выше 5 % в одном цикле или 10 % между циклами будут подвергнуты повторному анализу.

Конкретная цель 2: Определить влияние MCS на транспорт макронутриентов и эпигенетические модификации в плаценте и пуповинной крови. Для достижения этой цели исследователи определят экспрессию переносчиков жира и глюкозы, а также вышестоящие регулирующие пути AKT/mTOR в биоптатах плаценты участников. Исследователи будут измерять сайт-специфическое метилирование ДНК ключевых генов, связанных с ростом и метаболизмом, в плаценте и пуповинной крови.

Анализ маркеров транспорта макронутриентов в плацентарных биоптатах. Чтобы проанализировать, как метаболизм холина может быть связан с плацентарным транспортом жира и глюкозы, исследователи будут использовать ПЦР в реальном времени для количественной оценки содержания мРНК генов и транспортеров метаболизма жира и глюкозы, таких как переносчики глюкозы GLUT1. и GLUT3, гены липопротеинлипазы (LPL), связанные с метаболизмом жирных кислот, транслоказы жирных кислот (CD36), FATP и транспортеры аминокислот SNAT2 и SNAT4. Изобилие соответствующих белков, а также фосфорилирование AKT и mTOR-мишеней 4EBP1 и S6K (указывающее на активацию пути) также будет измеряться вестерн-блоттингом, который обычно проводится в лаборатории соисследователя, который включает SDS-PAGE, перенос мембраны, инкубация с антителами и визуализация с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Эффективность всех праймеров и качество антител проверяются перед использованием. И ПЦР в реальном времени, и вестерн-блоттинг будут проводиться в трех экземплярах.

Эпигенетическая регуляция роста и метаболизма: исследователи изучат сайт-специфическое метилирование ДНК генов, которые были опубликованы в предыдущих исследованиях как чувствительные к пренатальному воздействию и опосредующие долгосрочный рост и метаболическое программирование потомства, используя бисульфитное секвенирование, как это было ранее. . Вкратце, геномная ДНК будет обработана бисульфитным реагентом, после чего целевая геномная область будет амплифицирована с помощью ПЦР. Система MassArray EpiTyper будет использоваться для количественного определения метилированных последовательностей. Представляющие интерес гены включают LEP, SREBP1C и PPARG, которые опосредуют жировой обмен, IGF2, который способствует росту, кортикотропин-рилизинг-гормон (CRH), который способствует секреции кортизола, и глюкокортикоидный рецептор (GR), который получает сигналы кортизола.