Supplemento di colina sulla crescita fetale nel diabete mellito gestazionale

OBIETTIVI DELLO STUDIO Obiettivo specifico 1: Determinare l'effetto della MCS durante la gravidanza sul peso alla nascita nel GDM.

Obiettivo specifico 2: Determinare l'influenza della MCS sul trasporto dei macronutrienti e sulle modificazioni epigenetiche nella placenta e nel sangue cordonale.

IPOTESI

Obiettivo 1: I ricercatori ipotizzano che il gruppo colina avrebbe un peso alla nascita inferiore e meno neonati LGA rispetto al gruppo non colina.

Obiettivo 2: I ricercatori ipotizzano che il gruppo colina ridurrebbe il trasporto placentare e aumenterebbe la metilazione del DNA dei geni metabolici.

PROGETTAZIONE DI STUDIO

Soggetti: Verrà adottata una comoda metodologia di campionamento. Gli investigatori recluteranno donne incinte con diagnosi di GDM durante il secondo trimestre di gravidanza su base continuativa. La randomizzazione a blocchi sarà condotta sulla base di metodi di trattamento (ad es. terapia insulinica, ipoglicemizzanti orali o solo dieta) per assegnare in modo casuale i partecipanti ai gruppi di intervento e di controllo. Il reclutamento sarà condotto utilizzando i seguenti metodi: (i) i volantini dello studio saranno affissi presso la clinica prenatale; (ii) gli investigatori identificheranno le donne incinte potenzialmente idonee esaminando le cartelle cliniche.

Criteri di ammissibilità: i criteri di inclusione includono le donne in gravidanza GDM prima della settimana gestazionale 28. Al GDM viene diagnosticato il processo in 2 fasi: glicemia superiore al valore di cut-off di 140 mg/dL dopo 50 g non a digiuno di 1 ora e 100 g di 3 ore di glucosio orale. Le donne incinte sono qualificate per partecipare se parlano inglese o spagnolo, hanno più di 18 anni, hanno una gravidanza singola, intendono partorire presso l'istituto e sono prive di qualsiasi delle condizioni elencate nei criteri di esclusione. I criteri di esclusione includono iperglicemia preesistente, diabete, condizioni cardiovascolari e malattie del fegato prima della gravidanza. I pazienti possono scegliere di partecipare allo studio e non donare una biopsia della placenta o del cordone ombelicale. I pazienti che desiderano la donazione o la conservazione di cellule staminali non potranno donare una biopsia della placenta o del cordone ombelicale. Questi pazienti non saranno esclusi dall'analisi primaria.

Procedure di progettazione e raccolta dati:

Tutte le interazioni con i partecipanti avverranno presso l'ospedale di consegna mentre le analisi dei campioni avverranno presso il College in cui si trova il laboratorio del co-ricercatore. Il coordinatore dello studio, impiegato dai co-investigatori (Brooklyn College), non accederà né memorizzerà i dati in remoto e tutta la raccolta e l'analisi dei dati avverrà nel campus dell'ospedale.

Gli investigatori otterranno il consenso informato scritto dalle donne in gravidanza prima dell'ingresso nello studio. La randomizzazione verrà effettuata dalla farmacia dopo che il paziente avrà firmato il consenso. Sarà la randomizzazione a blocchi di 6 pazienti. Dopo la randomizzazione, gli investigatori forniranno al partecipante al gruppo di intervento pillole di supplemento di colina contenenti 500 mg di colina bitartrato (235 mg di colina, Douglas Lab). Il partecipante consumerà 2 pillole al giorno per ottenere 470 mg di colina per 8 settimane. L'assunzione raccomandata di colina sotto forma di assunzione adeguata (AI) è di 450 mg/die per le donne in gravidanza e il livello di assunzione massima tollerabile (UL) è di 3500 mg/die. Poiché meno del 10% delle donne in gravidanza raggiunge l'IA dell'assunzione di colina e il quartile superiore dell'assunzione di colina è inferiore a 900 mg/die. Il dosaggio che gli investigatori forniscono più l'assunzione abituale di colina in queste donne in gravidanza cadrà tra AI e UL, cioè sufficiente ma non superiore al limite. I partecipanti al gruppo di controllo riceveranno un placebo. Entrambi i gruppi riceveranno anche multivitaminici prenatali standard. Gli investigatori forniranno ai partecipanti una fornitura di integratori per 5 settimane e gli investigatori verificheranno la loro conformità durante il tempo con i registri di check-off giornalieri del consumo di integratori e il conteggio delle pillole rimanenti durante la loro prossima visita.

I partecipanti entreranno per un totale di 3 visite durante le cure cliniche di routine. La prima visita sarà tra le 24 e le 28 settimane di gestazione quando gli investigatori iscriveranno i partecipanti, la seconda visita sarà tra le 28 e le 32 settimane di gestazione e la terza visita sarà tra le 32 e le 36 settimane. Gli investigatori raccoglieranno un questionario di riferimento alla prima visita (circa 20 minuti), effettueranno richiami dietetici di 3 giorni dopo la prima visita (circa 20 minuti ciascuno), controlleranno il peso attuale e raccoglieranno 20 ml di campioni di sangue a tutte le visite. Alla consegna, gli investigatori raccoglieranno campioni di placenta e sangue del cordone dai partecipanti.

Questionario di base: il questionario include informazioni demografiche e mediche come età, data di scadenza, etnia, parità, stato civile, livello di istruzione, occupazione, reddito familiare, assicurazione medica, uso di sostanze, uso di farmaci, integratore alimentare, storia familiare di malattie croniche, e peso pre-gravidanza autodichiarato.

Valutazione dietetica: tre richiami dietetici di 24 ore, 2 nei giorni feriali e 1 in un giorno del fine settimana, saranno ottenuti da ciascun partecipante da un assistente di ricerca qualificato (RA) tramite telefonate dopo le prime visite per quantificare l'assunzione di colina nella dieta. Verrà utilizzato il metodo multi-pass di Harnack e colleghi. La RA registrerà l'identificazione degli alimenti, la quantità, le specifiche degli ingredienti, il metodo di preparazione e inserirà i dati nel software Nutrition Data System for Research (NDSR) per analizzare l'assunzione di colina. La RA chiederà inoltre ai partecipanti la loro attività fisica (PA) durante le ultime 24 ore utilizzando lo strumento di richiamo PA.

Misurazioni antropometriche e raccolta del sangue: gli investigatori misureranno il peso e l'altezza dei partecipanti utilizzando una bilancia medica con aste meccaniche durante le visite. Per ridurre al minimo le differenze di concentrazione legate al cibo nei biomarcatori plasmatici, ai partecipanti verrà chiesto di non consumare cibo per almeno 4 ore prima del prelievo di sangue al mattino. Questa è una raccomandazione standard per le visite prenatali ed è considerata sicura. Circa 20 ml di sangue venoso a digiuno verranno prelevati da ciascun partecipante durante le visite da un investigatore. I campioni di sangue saranno raccolti in una provetta per la raccolta del sangue con EDTA e una provetta per il separatore di siero e centrifugati per ottenere plasma, buffy coat e siero. I campioni verranno processati e conservati a -80oC presso il laboratorio fino al momento dell'utilizzo per le misurazioni analitiche.

Gestione della glicemia: gli investigatori otterranno informazioni sulla glicemia a digiuno, l'emoglobina A1C, i farmaci e la terapia insulinica dalle cartelle cliniche dei partecipanti.

Informazioni sulla nascita e raccolta del campione alla consegna: i partecipanti informeranno gli investigatori quando saranno ammessi al centro di nascita per telefono. Gli investigatori invieranno loro anche promemoria man mano che le date di scadenza si avvicinano. Inoltre, al personale medico del centro di nascita verrà fornito un elenco dei nomi dei partecipanti, quindi contatterà anche gli investigatori se un partecipante effettua il check-in quando nessuno del personale dello studio è sul posto. Una volta partorito il bambino, gli investigatori raccoglieranno due provette di sangue del cordone ombelicale per recuperare siero, plasma e buffy coat. Gli investigatori misureranno le dimensioni e il peso della placenta ed elaboreranno la placenta utilizzando il seguente metodo: biopsie placentari a tutto spessore saranno ottenute utilizzando un punzone Keyes da 6 mm e stabilizzate in RNAlater® (per RNA) o congelate in azoto liquido (per altri scopi). I campioni verranno trasportati al laboratorio del co-ricercatore per la conservazione a lungo termine a -80°C prima dell'uso.

Valutazione dell'assunzione dietetica: come accennato in precedenza, i dati sull'assunzione dietetica raccolti dai richiami dietetici di 3 giorni saranno analizzati dal software NDSR. L'assunzione giornaliera di colina totale sarà calcolata moltiplicando la frequenza di consumo per la somma dei derivati ​​della colina, tra cui colina libera, fosfatidilcolina (PC), glicerofosfocolina (GPC), fosfocolina e sfingomielina di ciascun alimento. L'assunzione giornaliera di betaina (il prodotto di ossidazione della colina) sarà calcolata moltiplicando la frequenza di consumo e il contenuto di betaina di ciascun alimento. L'assunzione giornaliera media sarà calcolata come il consumo medio giornaliero di colina totale e betaina nei 3 giorni di richiami dietetici.

Misurazioni dei metaboliti della colina: colina libera, betaina e altri derivati ​​della colina [ad es. PC, GPC, lisofosfatidilcolina, dimetilglicina, ossido di trimetilammina (TMAO)] saranno misurati nel plasma materno mediante cromatografia liquida (LC)-spettrometria di massa (MS)/MS come è stato condotto in studi precedenti. Per garantire l'accuratezza e la riproducibilità dei dati, nell'estrazione verranno utilizzati standard marcati con isotopi stabili, tutti i campioni saranno quantificati sulla base di una curva standard a 6 punti e ciascun campione verrà analizzato in duplicato. I campioni con un coefficiente di variazione (CV) % superiore al 5% all'interno di un'analisi o al 10% tra un'analisi e l'altra verranno analizzati nuovamente.

Obiettivo specifico 2: Determinare l'influenza della MCS sul trasporto dei macronutrienti e sulle modificazioni epigenetiche nella placenta e nel sangue cordonale. Per raggiungere questo obiettivo, i ricercatori determineranno l'espressione dei trasportatori di grasso e glucosio, nonché i percorsi di regolazione a monte AKT / mTOR nelle biopsie placentari dei partecipanti. Gli investigatori misureranno la metilazione del DNA sito-specifica dei geni chiave correlati alla crescita e al metabolismo nella placenta e nel sangue del cordone ombelicale.

Analisi dei marcatori di trasporto dei macronutrienti nelle biopsie placentari: per analizzare come il metabolismo della colina può essere correlato al trasporto placentare di grasso e glucosio, i ricercatori utilizzeranno la PCR in tempo reale per quantificare l'abbondanza di mRNA di geni metabolici e trasportatori di grasso e glucosio, come i trasportatori di glucosio GLUT1 e GLUT3, geni correlati al metabolismo degli acidi grassi lipoproteina lipasi (LPL), translocasi degli acidi grassi (CD36), FATP e trasportatori di amminoacidi SNAT2 e SNAT4. L'abbondanza delle rispettive proteine, così come la fosforilazione di AKT e gli obiettivi mTOR 4EBP1 e S6K (indicativi dell'attivazione del percorso) saranno misurati anche mediante western blotting che viene regolarmente condotto nel laboratorio del co-ricercatore, che include SDS-PAGE, trasferimento di membrana, incubazione con anticorpi e visualizzazione con un sistema di imaging a chemiluminescenza. Tutta l'efficienza dei primer e la qualità degli anticorpi saranno testati prima di essere utilizzati. Sia la PCR in tempo reale che il western blot verranno eseguiti in triplice copia.

Regolazione epigenetica della crescita e del metabolismo: i ricercatori esamineranno la metilazione del DNA sito-specifica dei geni che sono stati pubblicati da studi precedenti come suscettibili alle esposizioni prenatali e che mediano la crescita a lungo termine e la programmazione metabolica della prole utilizzando il sequenziamento del bisolfito come precedentemente condotto . In breve, il DNA genomico sarà trattato con reagente bisolfito, dopodiché la regione genomica bersaglio sarà amplificata mediante PCR. Un sistema MassArray EpiTyper sarà utilizzato per quantificare le sequenze metilate. I geni di interesse includono LEP, SREBP1C e PPARG che media il metabolismo dei grassi, IGF2 che promuove la crescita, l'ormone di rilascio della corticotropina (CRH) che promuove la secrezione di cortisolo e il recettore dei glucocorticoidi (GR) che riceve segnali di cortisolo.