Cholin-Supplementierung auf das fötale Wachstum bei Gestationsdiabetes mellitus

STUDIENZIELE Spezifisches Ziel 1: Bestimmung der Wirkung von MCS während der Schwangerschaft auf das Geburtsgewicht bei GDM.

Spezifisches Ziel 2: Bestimmung des Einflusses von MCS auf den Transport von Makronährstoffen und epigenetische Modifikationen in Plazenta und Nabelschnurblut.

HYPOTHESE

Ziel 1: Die Forscher gehen von der Hypothese aus, dass die Cholin-Gruppe ein niedrigeres Geburtsgewicht und weniger LGA-Neugeborene hätte als die Nicht-Cholin-Gruppe.

Ziel 2: Die Forscher stellen die Hypothese auf, dass die Cholin-Gruppe den Transport durch die Plazenta verringern und die DNA-Methylierung von Stoffwechselgenen erhöhen würde.

STUDIENDESIGN

Themen: Es wird eine geeignete Stichprobenmethode angewendet. Die Ermittler rekrutieren fortlaufend schwangere Frauen, bei denen GDM während des zweiten Schwangerschaftstrimesters diagnostiziert wurde. Die Block-Randomisierung wird basierend auf Behandlungsmethoden durchgeführt (d. h. Insulintherapie, orale Hypoglykämie oder nur Diät), um die Teilnehmer nach dem Zufallsprinzip den Interventions- und Kontrollgruppen zuzuweisen. Die Rekrutierung wird mit den folgenden Methoden durchgeführt: (i) Studienflyer werden in der Pränatalklinik ausgehängt; (ii) die Ermittler identifizieren schwangere Frauen, die potenziell in Frage kommen, indem sie die Krankenakten überprüfen.

Auswahlkriterien: Die Einschlusskriterien umfassen GDM-Schwangere vor der 28. Schwangerschaftswoche. GDM wird mit dem 2-Stufen-Prozess diagnostiziert: Blutzucker höher als der Cut-off-Wert von 140 mg/dL nach 50 g nicht nüchternen 1-stündigen und 100 g 3-stündigen oralen Glukose-Provokationen. Schwangere Frauen sind zur Teilnahme berechtigt, wenn sie Englisch oder Spanisch sprechen, über 18 Jahre alt sind, eine Einlingsschwangerschaft haben, beabsichtigen, ihre Babys in der Einrichtung zur Welt zu bringen, und keine der in den Ausschlusskriterien aufgeführten Bedingungen erfüllen. Ausschlusskriterien sind vorbestehende Hyperglykämie, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Lebererkrankungen vor der Schwangerschaft. Patienten können sich dafür entscheiden, an der Studie teilzunehmen und keine Biopsie ihrer Plazenta oder Nabelschnur zu spenden. Patienten, die eine Stammzellenspende oder -lagerung wünschen, können keine Biopsie ihrer Plazenta oder Nabelschnur spenden. Diese Patienten werden nicht von der Primäranalyse ausgeschlossen.

Entwurfs- und Datenerhebungsverfahren:

Alle Interaktionen mit den Teilnehmern finden im entsendenden Krankenhaus statt, während die Probenanalysen am College stattfinden, wo sich das Labor des Co-Ermittlers befindet. Der Koordinator für die Studie, der von den Co-Ermittlern (Brooklyn College) angestellt ist, wird nicht aus der Ferne auf Daten zugreifen oder diese speichern, und die gesamte Datenerfassung und -analyse findet auf dem Krankenhauscampus statt.

Die Prüfärzte holen vor Eintritt in die Studie eine schriftliche Einverständniserklärung der schwangeren Frauen ein. Die Randomisierung erfolgt durch die Apotheke, nachdem der Patient seine Einwilligung erteilt hat. Es wird eine Block-Randomisierung von 6 Patienten sein. Nach der Randomisierung werden die Ermittler dem Teilnehmer der Interventionsgruppe Cholin-Ergänzungspillen mit 500 mg Cholinbitartrat (235 mg Cholin, Douglas Lab) zur Verfügung stellen. Der Teilnehmer nimmt 2 Pillen pro Tag ein, um 8 Wochen lang 470 mg Cholin zu erhalten. Die empfohlene Aufnahme von Cholin in Form einer angemessenen Aufnahme (AI) beträgt 450 mg/Tag für schwangere Frauen und die tolerierbare obere Aufnahmemenge (UL) beträgt 3500 mg/Tag. Da weniger als 10 % der Schwangeren den AI der Cholinaufnahme erreichen und das obere Quartil der Cholinaufnahme unter 900 mg/d liegt. Die Dosierung, die die Ermittler verabreichen, plus die gewöhnliche Aufnahme von Cholin bei diesen schwangeren Frauen, wird zwischen AI und UL liegen, d. h. ausreichend sein, aber den Grenzwert nicht überschreiten. Die Teilnehmer der Kontrollgruppe erhalten ein Placebo. Beide Gruppen erhalten außerdem pränatale Standard-Multivitamine. Die Ermittler stellen den Teilnehmern Nahrungsergänzungsmittel für 5 Wochen zur Verfügung, und die Ermittler überprüfen ihre Einhaltung während der Zeit mit täglichen Check-off-Protokollen des Nahrungsergänzungsmittelverbrauchs und der Anzahl der übrig gebliebenen Pillen bei ihrem nächsten Besuch.

Die Teilnehmer werden zu Zeiten der routinemäßigen klinischen Versorgung zu insgesamt 3 Besuchen kommen. Der erste Besuch findet zwischen der 24. und 28. Schwangerschaftswoche statt, wenn die Ermittler die Teilnehmer einschreiben, der zweite Besuch findet zwischen der 28. und 32. Schwangerschaftswoche statt und der dritte Besuch findet zwischen der 32. und 36. Woche statt. Die Ermittler werden beim ersten Besuch (ca. 20 Minuten) einen Baseline-Fragebogen sammeln, nach dem ersten Besuch 3 Tage lang Ernährungserinnerungen durchführen (jeweils ca. 20 Minuten) und das aktuelle Gewicht überprüfen und bei allen Besuchen 20 ml Blutproben entnehmen. Bei der Entbindung sammeln die Ermittler Plazentaproben und Nabelschnurblut von den Teilnehmern.

Baseline-Fragebogen: Der Fragebogen enthält demografische und medizinische Informationen wie Alter, Fälligkeitsdatum, ethnische Zugehörigkeit, Parität, Familienstand, Bildungsniveau, Beruf, Haushaltseinkommen, Krankenversicherung, Substanzgebrauch, Medikamentengebrauch, Nahrungsergänzung, Familiengeschichte von chronischen Krankheiten, und selbstberichtetes Gewicht vor der Schwangerschaft.

Ernährungsbewertung: Drei 24-Stunden-Ernährungsrückrufe, 2 an Wochentagen und 1 an einem Wochenendtag, werden von jedem Teilnehmer von einem ausgebildeten Forschungsassistenten (RA) per Telefonanruf nach den ersten Besuchen zur Quantifizierung der Cholinaufnahme über die Nahrung erhalten. Es wird das Multi-Pass-Verfahren von Harnack und Kollegen verwendet. Die RA zeichnet die Lebensmittelidentifikation, Menge, Inhaltsstoffspezifikation und Zubereitungsmethode auf und gibt Daten in die Software Nutrition Data System for Research (NDSR) ein, um die Cholinaufnahme zu analysieren. Die RA fragt die Teilnehmer auch nach ihrer körperlichen Aktivität (PA) während der letzten 24 Stunden unter Verwendung des PA-Recall-Instruments.

Anthropometrische Messungen und Blutabnahme: Die Untersucher messen während der Visiten das Gewicht und die Größe der Teilnehmer mit einer medizinischen Waage mit mechanischen Messstäben. Um ernährungsbedingte Konzentrationsunterschiede bei Plasma-Biomarkern zu minimieren, werden die Teilnehmer angewiesen, mindestens 4 Stunden vor der morgendlichen Blutentnahme keine Nahrung zu sich zu nehmen. Dies ist eine Standardempfehlung für vorgeburtliche Besuche und gilt als sicher. Etwa 20 ml nüchternes venöses Blut werden jedem Teilnehmer während der Besuche durch einen Untersucher entnommen. Blutproben werden in ein EDTA-Blutentnahmeröhrchen und ein Serumtrennröhrchen gesammelt und zentrifugiert, um Plasma, Buffy Coat und Serum zu erhalten. Die Proben werden verarbeitet und bei -80 °C im Labor gelagert, bis sie für analytische Messungen verwendet werden.

Blutzuckermanagement: Die Prüfärzte erhalten Informationen über Nüchternglukose, Hämoglobin A1C, Medikamente und Insulintherapie aus Krankenakten der Teilnehmer.

Geburtsinformation und Probenentnahme bei der Entbindung: Die Teilnehmerinnen melden sich bei der Aufnahme im Geburtshaus telefonisch bei den Untersuchern. Die Ermittler senden ihnen auch Erinnerungen, wenn sich ihre Fälligkeitstermine nähern. Darüber hinaus erhält das medizinische Personal des Geburtshauses eine Liste mit den Namen der Teilnehmer, so dass es die Prüfärzte auch kontaktiert, wenn ein Teilnehmer eincheckt, wenn kein Studienpersonal vor Ort ist. Sobald das Baby geboren ist, werden die Ermittler zwei Röhrchen Nabelschnurblut entnehmen, um Serum, Plasma und Buffy Coat zu gewinnen. Die Ermittler messen die Größe und das Gewicht der Plazenta und verarbeiten die Plazenta mit der folgenden Methode: Plazentabiopsien in voller Dicke werden mit einer 6-mm-Keyes-Stanze entnommen und in RNAlater® (für RNA) stabilisiert oder in flüssigem Stickstoff eingefroren (für andere Zwecke). Die Proben werden vor der Verwendung zur Langzeitlagerung bei -80 °C in das Labor des Mitforschers transportiert.

Bewertung der Nahrungsaufnahme: Wie oben erwähnt, werden Daten zur Nahrungsaufnahme, die aus 3-tägigen Ernährungsrückrufen gesammelt wurden, von der NDSR-Software analysiert. Die tägliche Aufnahme von Gesamtcholin wird berechnet, indem die Konsumhäufigkeit mit der Summe der Cholinderivate, einschließlich freiem Cholin, Phosphatidylcholin (PC), Glycerophosphocholin (GPC), Phosphocholin und Sphingomyelin, jedes Lebensmittels multipliziert wird. Die tägliche Aufnahme von Betain (dem Oxidationsprodukt von Cholin) wird berechnet, indem die Verzehrhäufigkeit und der Betaingehalt jedes Lebensmittels multipliziert werden. Die durchschnittliche tägliche Aufnahme wird als die durchschnittliche tägliche Aufnahme von Gesamtcholin und Betain über die 3 Tage der Diätrückrufe berechnet.

Messungen von Cholinmetaboliten: Freies Cholin, Betain und andere Cholinderivate [z.B. PC, GPC, Lysophosphatidylcholin, Dimethylglycin, Trimethylaminoxid (TMAO)] wird im mütterlichen Plasma unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie (LC)-Massenspektrometrie (MS)/MS gemessen, wie es in früheren Studien durchgeführt wurde. Um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten, werden mit stabilen Isotopen markierte Standards bei der Extraktion verwendet, alle Proben werden auf der Grundlage einer 6-Punkte-Standardkurve quantifiziert und jede Probe wird doppelt analysiert. Proben mit einem prozentualen Variationskoeffizienten (VK) von mehr als 5 % innerhalb des Laufs oder 10 % zwischen den Läufen werden erneut analysiert.

Spezifisches Ziel 2: Bestimmung des Einflusses von MCS auf den Transport von Makronährstoffen und epigenetische Modifikationen in Plazenta und Nabelschnurblut. Um dieses Ziel zu erreichen, werden die Forscher die Expression von Fett- und Glukosetransportern sowie die vorgeschalteten Regulationswege AKT/mTOR in Plazentabiopsien der Teilnehmer bestimmen. Die Forscher werden die ortsspezifische DNA-Methylierung von Schlüsselgenen für Wachstum und Stoffwechsel in der Plazenta und im Nabelschnurblut messen.

Analysen von Makronährstoff-Transportmarkern in Plazentabiopsien: Um zu analysieren, wie der Cholinstoffwechsel mit dem Fett- und Glukosetransport in der Plazenta zusammenhängen kann, werden die Forscher Echtzeit-PCR verwenden, um die mRNA-Häufigkeit von Genen und Transportern des Fett- und Glukosestoffwechsels wie Glukosetransporter GLUT1 zu quantifizieren und GLUT3, mit dem Fettsäurestoffwechsel zusammenhängende Gene Lipoproteinlipase (LPL), Fettsäure-Translokase (CD36), FATPs und die Aminosäuretransporter SNAT2 und SNAT4. Die Häufigkeit der jeweiligen Proteine ​​sowie die Phosphorylierung von AKT und mTOR-Zielen 4EBP1 und S6K (die auf die Aktivierung des Signalwegs hinweisen) werden auch durch Western Blotting gemessen, das routinemäßig im Labor des Mitforschers durchgeführt wird, einschließlich SDS-PAGE, Membrantransfer, Inkubation mit Antikörpern und Visualisierung mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Alle Primer-Effizienz und Antikörperqualität werden vor der Verwendung getestet. Sowohl Echtzeit-PCR als auch Western Blot werden dreifach durchgeführt.

Epigenetische Regulierung von Wachstum und Stoffwechsel: Die Forscher werden die ortsspezifische DNA-Methylierung von Genen untersuchen, die in früheren Studien als anfällig für pränatale Expositionen veröffentlicht wurden und das langfristige Wachstum und die metabolische Programmierung der Nachkommen vermitteln, indem sie die zuvor durchgeführte Bisulfit-Sequenzierung verwenden . Kurz gesagt wird genomische DNA mit Bisulfit-Reagenz behandelt, wonach die genomische Zielregion durch PCR amplifiziert wird. Zur Quantifizierung methylierter Sequenzen wird ein MassArray EpiTyper-System verwendet. Zu den interessierenden Genen gehören LEP, SREBP1C und PPARG, das den Fettstoffwechsel vermittelt, IGF2, das das Wachstum fördert, das Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH), das die Cortisol-Sekretion fördert, und der Glucocorticoid-Rezeptor (GR), der Cortisol-Signale empfängt.