Suplementação de colina no crescimento fetal em diabetes mellitus gestacional

OBJETIVOS DO ESTUDO Objetivo Específico 1: Determinar o efeito do MCS durante a gravidez sobre o peso ao nascer no GDM.

Objetivo Específico 2: Determinar a influência do MCS no transporte de macronutrientes e modificações epigenéticas na placenta e no sangue do cordão umbilical.

HIPÓTESE

Objetivo 1: Os investigadores levantaram a hipótese de que o grupo da colina teria menor peso ao nascer e menos recém-nascidos GIG do que o grupo sem colina.

Objetivo 2: Os investigadores levantam a hipótese de que o grupo da colina reduziria o transporte placentário e aumentaria a metilação do DNA de genes metabólicos.

DESIGN DE ESTUDO

Sujeitos: Será adotada uma metodologia de amostragem conveniente. Os investigadores irão recrutar mulheres grávidas diagnosticadas com DMG durante o segundo trimestre da gravidez de forma contínua. A randomização do bloco será conduzida com base nos métodos de tratamento (ou seja, terapia com insulina, hipoglicemiantes orais ou apenas dieta) para atribuir aleatoriamente os participantes aos grupos de intervenção e controle. O recrutamento será conduzido usando os seguintes métodos: (i) folhetos do estudo serão afixados na clínica pré-natal; (ii) os investigadores identificarão as mulheres grávidas que são potencialmente elegíveis, revisando os registros médicos.

Critérios de Elegibilidade: Os critérios de inclusão incluem gestantes DMG antes da 28ª semana gestacional. O DMG é diagnosticado com o processo de 2 etapas: glicose no sangue superior ao valor de corte de 140 mg/dL após 50 g sem jejum de 1 hora e 100 g de glicose oral de 3 horas. Estão habilitadas a participar gestantes que falem inglês ou espanhol, sejam maiores de 18 anos, tenham gestação única, pretendam ter o bebê na instituição e não apresentem nenhuma das condições listadas nos critérios de exclusão. Os critérios de exclusão incluem hiperglicemia pré-existente, diabetes, condições cardiovasculares e doença hepática antes da gravidez. Os pacientes podem optar por participar do estudo e não doar uma biópsia de placenta ou cordão umbilical. Os pacientes que desejam doar ou armazenar células-tronco não poderão doar uma biópsia de placenta ou cordão umbilical. Esses pacientes não serão excluídos da análise primária.

Procedimentos de projeto e coleta de dados:

Toda a interação com os participantes ocorrerá no hospital de entrega, enquanto as análises das amostras ocorrerão na faculdade onde o laboratório do co-investigador está localizado. O coordenador do estudo, empregado pelos co-investigadores (Brooklyn College), não acessará ou armazenará dados remotamente e toda a coleta e análise de dados ocorrerá no campus do hospital.

Os investigadores obterão o consentimento informado por escrito das mulheres grávidas antes da entrada no estudo. A randomização será feita pela farmácia após o paciente assinar o consentimento. Será randomização em bloco de 6 pacientes. Após a randomização, os investigadores fornecerão ao participante do grupo de intervenção pílulas de suplemento de colina contendo 500 mg de bitartarato de colina (235 mg de colina, Douglas Lab). O participante consumirá 2 comprimidos por dia para obter 470 mg de colina por 8 semanas. A ingestão recomendada de colina na forma de Ingestão Adequada (AI) é de 450 mg/d para mulheres grávidas e o Nível Superior Tolerável de Ingestão (UL) é de 3500 mg/d. Uma vez que menos de 10% das gestantes atingem o IA de ingestão de colina e o quartil superior de ingestão de colina está abaixo de 900 mg/d. A dosagem que os investigadores fornecem mais a ingestão habitual de colina nessas mulheres grávidas cairá entre o AI e o UL, ou seja, suficiente, mas não excedendo o limite. Os participantes do grupo controle receberão um placebo. Ambos os grupos também receberão multivitaminas pré-natais padrão. Os investigadores fornecerão aos participantes um suprimento de suplementos para 5 semanas e os investigadores verificarão sua conformidade durante o período com registros diários de consumo de suplemento e contagem de pílulas restantes durante sua próxima visita.

Os participantes farão um total de 3 consultas em horários de atendimento clínico de rotina. A primeira visita será entre 24 e 28 semanas de gestação quando os investigadores inscreverem os participantes, a segunda visita será entre 28 e 32 semanas de gestação e a terceira visita será entre 32 e 36 semanas. Os investigadores coletarão um questionário de linha de base na primeira visita (aproximadamente 20 minutos), conduzirão recordatórios alimentares de 3 dias após a primeira visita (aproximadamente 20 minutos, cada) e verificarão o peso atual e coletarão amostras de sangue de 20 mL em todas as visitas. No momento do parto, os investigadores coletarão amostras de placenta e sangue do cordão umbilical dos participantes.

Questionário de linha de base: O questionário inclui informações demográficas e médicas, como idade, data do parto, etnia, paridade, estado civil, nível educacional, ocupação, renda familiar, seguro médico, uso de substâncias, uso de medicamentos, suplemento nutricional, histórico familiar de doenças crônicas, e peso pré-gestacional autorreferido.

Avaliação dietética: Três recordatórios alimentares de 24 horas, 2 durante a semana e 1 no fim de semana, serão obtidos de cada participante por um assistente de pesquisa treinado (RA) por meio de telefonemas após as primeiras visitas para quantificar a ingestão de colina na dieta. O método multi-pass de Harnack e colegas será usado. O RA registrará a identificação do alimento, quantidade, especificação do ingrediente, método de preparação e inserirá os dados no software Nutrition Data System for Research (NDSR) para analisar a ingestão de colina. O RA também perguntará aos participantes sobre sua atividade física (AF) durante as últimas 24 horas usando o instrumento de recordação de AF.

Medidas antropométricas e coleta de sangue: Os investigadores medirão o peso e a altura dos participantes usando uma balança médica com hastes mecânicas de altura durante as visitas. Para minimizar as diferenças de concentração relacionadas aos alimentos nos biomarcadores plasmáticos, os participantes serão instruídos a não consumir alimentos por pelo menos 4 horas antes da coleta de sangue pela manhã. Esta é uma recomendação padrão para consultas de pré-natal e é considerada segura. Cerca de 20 mL de sangue venoso em jejum serão coletados de cada participante durante as visitas de um investigador. As amostras de sangue serão coletadas em um tubo de coleta de sangue EDTA e um tubo separador de soro e centrifugadas para obter plasma, buffy coat e soro. As amostras serão processadas e armazenadas a -80oC no laboratório até serem utilizadas para medições analíticas.

Controle da glicemia: Os investigadores obterão informações sobre glicemia de jejum, hemoglobina A1C, medicação e terapia com insulina nos prontuários dos participantes.

Informações sobre o nascimento e coleta de amostras no momento do parto: As participantes notificarão os investigadores quando forem admitidas na casa de parto por telefone. Os investigadores também enviarão lembretes quando as datas de vencimento estiverem se aproximando. Além disso, a equipe médica do centro de parto receberá uma lista dos nomes dos participantes, portanto, eles também entrarão em contato com os investigadores se um participante fizer check-in quando nenhum membro da equipe do estudo estiver no local. Assim que o bebê nascer, os investigadores coletarão dois tubos de sangue do cordão umbilical para coletar soro, plasma e buffy coat. Os investigadores medirão o tamanho e o peso da placenta e processarão a placenta usando o seguinte método: biópsias de espessura total da placenta serão obtidas usando um punção Keyes de 6 mm e estabilizadas em RNAlater® (para RNA) ou congeladas em nitrogênio líquido (para outros fins). As amostras serão transportadas para o laboratório do co-investigador para armazenamento de longo prazo a -80C antes do uso.

Avaliação da ingestão alimentar: Conforme mencionado acima, os dados de ingestão alimentar coletados a partir de recordatórios alimentares de 3 dias serão analisados ​​pelo software NDSR. A ingestão diária de colina total será calculada multiplicando a frequência de consumo pela soma dos derivados de colina, incluindo colina livre, fosfatidilcolina (PC), glicerofosfocolina (GPC), fosfocolina e esfingomielina de cada item alimentar. A ingestão diária de betaína (o produto de oxidação da colina) será calculada multiplicando a frequência de consumo e o conteúdo de betaína de cada alimento. As ingestões diárias médias serão calculadas como o consumo diário médio de colina total e betaína durante os 3 dias de recordatórios alimentares.

Medições de metabólitos de colina: Colina livre, betaína e outros derivados de colina [p. PC, GPC, lisofosfatidilcolina, dimetilglicina, óxido de trimetilamina (TMAO)] serão medidos no plasma materno usando cromatografia líquida (LC)-espectrometria de massa (MS) /MS como foi conduzido em estudos anteriores. Para garantir a precisão e a reprodutibilidade dos dados, padrões marcados com isótopos estáveis ​​serão usados ​​na extração, todas as amostras serão quantificadas com base em uma curva padrão de 6 pontos e cada amostra será processada em duplicata. Amostras com coeficiente de variação (CV) % superior a 5% dentro da execução ou 10% entre as execuções serão reprocessadas.

Objetivo Específico 2: Determinar a influência do MCS no transporte de macronutrientes e modificações epigenéticas na placenta e no sangue do cordão umbilical. Para atingir esse objetivo, os pesquisadores determinarão a expressão de transportadores de gordura e glicose, bem como as vias reguladoras a montante AKT/mTOR em biópsias placentárias dos participantes. Os investigadores medirão a metilação específica do DNA de genes-chave relacionados ao crescimento e ao metabolismo na placenta e no sangue do cordão umbilical.

Análises de marcadores de transporte de macronutrientes em biópsias placentárias: Para analisar como o metabolismo da colina pode estar relacionado ao transporte de gordura e glicose da placenta, os pesquisadores usarão PCR em tempo real para quantificar a abundância de mRNA de genes e transportadores metabólicos de gordura e glicose, como os transportadores de glicose GLUT1 e GLUT3, genes relacionados ao metabolismo de ácidos graxos lipoproteína lipase (LPL), translocase de ácidos graxos (CD36), FATPs e transportadores de aminoácidos SNAT2 e SNAT4. A abundância das respectivas proteínas, bem como a fosforilação de AKT, e os alvos mTOR 4EBP1 e S6K (indicativo de ativação da via) também serão medidos por western blotting que é realizado rotineiramente no laboratório do co-investigador, que inclui SDS-PAGE, transferência de membrana, incubação com anticorpos e visualização com um sistema de imagem de quimioluminescência. Toda a eficiência do primer e qualidade do anticorpo serão testadas antes de serem usadas. Tanto a PCR em tempo real quanto o western blot serão executados em triplicata.

Regulação epigenética do crescimento e metabolismo: os investigadores examinarão a metilação do DNA específica do local de genes que são publicados por estudos anteriores como suscetíveis a exposições pré-natais e mediam o crescimento de longo prazo e a programação metabólica da prole usando o sequenciamento de bissulfito, conforme conduzido anteriormente . Resumidamente, o DNA genômico será tratado com reagente bissulfito, após o que a região genômica alvo será amplificada por PCR. Um sistema MassArray EpiTyper será usado para quantificar as sequências metiladas. Os genes de interesse incluem LEP, SREBP1C e PPARG que medeiam o metabolismo da gordura, IGF2 que promove o crescimento, hormônio liberador de corticotropina (CRH) que promove a secreção de cortisol e receptor de glicocorticóide (GR) que recebe sinais de cortisol.