Suplementación con colina sobre el crecimiento fetal en la diabetes mellitus gestacional

OBJETIVOS DEL ESTUDIO Objetivo Específico 1: Determinar el efecto de MCS durante el embarazo sobre el peso al nacer en DMG.

Objetivo Específico 2: Determinar la influencia de MCS en el transporte de macronutrientes y modificaciones epigenéticas en la placenta y sangre de cordón umbilical.

HIPÓTESIS

Objetivo 1: Los investigadores plantean la hipótesis de que el grupo de colina tendría un peso al nacer más bajo y menos neonatos LGA que el grupo sin colina.

Objetivo 2: Los investigadores plantean la hipótesis de que el grupo de la colina reduciría el transporte placentario y aumentaría la metilación del ADN de los genes metabólicos.

DISEÑO DEL ESTUDIO

Sujetos: Se adoptará una metodología de muestreo conveniente. Los investigadores reclutarán a mujeres embarazadas diagnosticadas con DMG durante el segundo trimestre del embarazo de forma continua. La aleatorización de bloques se realizará en función de los métodos de tratamiento (es decir, tratamiento con insulina, hipoglucemiantes orales o solo dieta) para asignar aleatoriamente a los participantes a los grupos de intervención y control. El reclutamiento se llevará a cabo utilizando los siguientes métodos: (i) los folletos del estudio se publicarán en la clínica prenatal; (ii) los investigadores identificarán a las mujeres embarazadas que son potencialmente elegibles mediante la revisión de registros médicos.

Criterios de elegibilidad: Los criterios de inclusión incluyen mujeres embarazadas con DMG antes de la semana gestacional 28. La GDM se diagnostica con el proceso de 2 pasos: glucosa en sangre superior al valor de corte de 140 mg/dl después de 50 g sin ayunar durante 1 hora y 100 g de glucosa oral durante 3 horas. Las mujeres embarazadas califican para participar si hablan inglés o español, son mayores de 18 años, tienen un embarazo único, tienen la intención de dar a luz en la institución y no tienen ninguna de las condiciones enumeradas en los criterios de exclusión. Los criterios de exclusión incluyen hiperglucemia preexistente, diabetes, afecciones cardiovasculares y enfermedad hepática antes del embarazo. Los pacientes pueden optar por participar en el estudio y no donar una biopsia de su placenta o cordón umbilical. Los pacientes que deseen la donación o el almacenamiento de células madre no podrán donar una biopsia de su placenta o cordón umbilical. Estos pacientes no serán excluidos del análisis primario.

Procedimientos de diseño y recopilación de datos:

Toda la interacción con los participantes ocurrirá en el hospital de entrega, mientras que los análisis de muestras se realizarán en el Colegio donde se encuentra el laboratorio del co-investigador. El coordinador del estudio, empleado por los coinvestigadores (Brooklyn College), no accederá ni almacenará datos de forma remota y toda la recopilación y el análisis de datos se realizarán en el campus del hospital.

Los investigadores obtendrán el consentimiento informado por escrito de las mujeres embarazadas antes de ingresar al estudio. La farmacia realizará la aleatorización después de que el paciente firme el consentimiento. Será una aleatorización en bloques de 6 pacientes. Después de la aleatorización, los investigadores proporcionarán al participante en el grupo de intervención pastillas de suplemento de colina que contienen 500 mg de bitartrato de colina (235 mg de colina, Douglas Lab). El participante consumirá 2 pastillas por día para obtener 470 mg de colina durante 8 semanas. La ingesta recomendada de colina en forma de Ingesta Adecuada (AI) es de 450 mg/d para mujeres embarazadas y el Nivel Superior de Ingesta Tolerable (UL) es de 3500 mg/d. Ya que menos del 10% de las gestantes alcanzan la IA de ingesta de colina y el cuartil superior de ingesta de colina está por debajo de 900 mg/d. La dosis que aporten los investigadores más la ingesta habitual de colina en estas gestantes estará entre el AI y el UL, es decir, suficiente pero sin sobrepasar el límite. Los participantes del grupo de control recibirán un placebo. Ambos grupos también recibirán multivitaminas prenatales estándar. Los investigadores proporcionarán a los participantes un suministro de suplementos para 5 semanas y verificarán su cumplimiento durante el tiempo con registros diarios de consumo de suplementos y recuento de píldoras sobrantes durante su próxima visita.

Los participantes vendrán para un total de 3 visitas en momentos de atención clínica de rutina. La primera visita será entre las semanas 24 y 28 de gestación cuando los investigadores inscriban a las participantes, la segunda visita será entre las semanas 28 y 32 de gestación y la tercera visita será entre las semanas 32 y 36. Los investigadores recopilarán un cuestionario de referencia en la primera visita (aproximadamente 20 minutos), realizarán recordatorios dietéticos de 3 días después de la primera visita (aproximadamente 20 minutos cada uno) y verificarán el peso actual y recolectarán muestras de sangre de 20 ml en todas las visitas. En el momento del parto, los investigadores recolectarán muestras de placenta y sangre del cordón umbilical de las participantes.

Cuestionario de referencia: El cuestionario incluye información demográfica y médica como edad, fecha de parto, origen étnico, paridad, estado civil, nivel de educación, ocupación, ingresos del hogar, seguro médico, uso de sustancias, uso de medicamentos, suplementos nutricionales, antecedentes familiares de enfermedades crónicas, y peso previo al embarazo autoinformado.

Evaluación dietética: Un asistente de investigación capacitado (RA) obtendrá tres recordatorios dietéticos de 24 horas, 2 entre semana y 1 en un día de fin de semana, de cada participante a través de llamadas telefónicas después de las primeras visitas para cuantificar la ingesta de colina en la dieta. Se utilizará el método de pases múltiples de Harnack y colegas. El RA registrará la identificación de los alimentos, la cantidad, la especificación de los ingredientes, el método de preparación e ingresará los datos en el software del Sistema de datos de nutrición para la investigación (NDSR) para analizar la ingesta de colina. El RA también preguntará a los participantes sobre su actividad física (AF) durante las últimas 24 horas utilizando el instrumento de recordatorio de PA.

Mediciones antropométricas y extracción de sangre: Los investigadores medirán el peso y la altura de los participantes mediante una balanza médica con tallímetros mecánicos durante las visitas. Para minimizar las diferencias de concentración relacionadas con los alimentos en los biomarcadores plasmáticos, se indicará a los participantes que no consuman alimentos durante al menos 4 horas antes de la extracción de sangre por la mañana. Esta es una recomendación estándar para las visitas prenatales y se considera segura. Un investigador extraerá aproximadamente 20 ml de sangre venosa en ayunas de cada participante durante las visitas. Las muestras de sangre se recolectarán en un tubo de recolección de sangre con EDTA y un tubo separador de suero y se centrifugarán para obtener plasma, capa leucocitaria y suero. Las muestras se procesarán y almacenarán a -80oC en el laboratorio hasta que se utilicen para mediciones analíticas.

Manejo de la glucosa en sangre: Los investigadores obtendrán información sobre la glucosa en ayunas, la hemoglobina A1C, la medicación y la terapia con insulina de los expedientes médicos de los participantes.

Información de nacimiento y toma de muestras al momento del parto: Las participantes notificarán a los investigadores cuando sean admitidas en el centro de maternidad por teléfono. Los investigadores también les enviarán recordatorios a medida que se acerquen sus fechas de vencimiento. Además, el personal médico del centro de maternidad recibirá una lista de los nombres de los participantes, por lo que también se comunicarán con los investigadores si un participante se registra cuando nadie del personal del estudio está en el lugar. Una vez que nazca el bebé, los investigadores recolectarán dos tubos de sangre del cordón umbilical para recuperar el suero, el plasma y la capa leucocitaria. Los investigadores medirán el tamaño y el peso de la placenta y procesarán la placenta mediante el siguiente método: se obtendrán biopsias placentarias de espesor completo mediante un sacabocados Keyes de 6 mm y se estabilizarán en RNAlater® (para ARN) o se congelarán en nitrógeno líquido. (para otros fines). Las muestras se transportarán al laboratorio del co-investigador para su almacenamiento a largo plazo a -80C antes de su uso.

Evaluación de la ingesta dietética: como se mencionó anteriormente, el software NDSR analizará los datos de ingesta dietética recopilados de los recordatorios dietéticos de 3 días. La ingesta diaria de colina total se calculará multiplicando la frecuencia de consumo por la suma de los derivados de la colina, incluida la colina libre, la fosfatidilcolina (PC), la glicerofosfocolina (GPC), la fosfocolina y la esfingomielina de cada alimento. La ingesta diaria de betaína (el producto de oxidación de la colina) se calculará multiplicando la frecuencia de consumo y el contenido de betaína de cada alimento. Las ingestas diarias promedio se calcularán como el consumo diario promedio de colina y betaína totales durante los 3 días de recordatorios dietéticos.

Mediciones de metabolitos de colina: Colina libre, betaína y otros derivados de la colina [p. PC, GPC, lisofosfatidilcolina, dimetilglicina, óxido de trimetilamina (TMAO)] se medirán en plasma materno mediante cromatografía líquida (LC)-espectrometría de masas (MS)/MS como se realizó en estudios anteriores. Para garantizar la precisión y la reproducibilidad de los datos, en la extracción se utilizarán estándares marcados con isótopos estables, todas las muestras se cuantificarán en función de una curva estándar de 6 puntos y cada muestra se procesará por duplicado. Se volverán a analizar las muestras con un coeficiente de variación (CV) % superior al 5 % dentro de la serie o al 10 % entre series.

Objetivo Específico 2: Determinar la influencia de MCS en el transporte de macronutrientes y modificaciones epigenéticas en la placenta y sangre de cordón umbilical. Para lograr este objetivo, los investigadores determinarán la expresión de los transportadores de grasa y glucosa, así como las vías de regulación aguas arriba AKT/mTOR en biopsias de placenta de los participantes. Los investigadores medirán la metilación del ADN específica del sitio de genes clave relacionados con el crecimiento y el metabolismo en la placenta y la sangre del cordón umbilical.

Análisis de marcadores de transporte de macronutrientes en biopsias placentarias: para analizar cómo el metabolismo de la colina puede estar relacionado con el transporte de grasa y glucosa en la placenta, los investigadores utilizarán PCR en tiempo real para cuantificar la abundancia de ARNm de genes y transportadores metabólicos de grasa y glucosa, como los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3, genes relacionados con el metabolismo de los ácidos grasos lipoproteína lipasa (LPL), translocasa de ácidos grasos (CD36), FATP y transportadores de aminoácidos SNAT2 y SNAT4. La abundancia de las proteínas respectivas, así como la fosforilación de AKT, y los objetivos mTOR 4EBP1 y S6K (indicativos de la activación de la vía) también se medirán mediante transferencia de Western que se realiza de forma rutinaria en el laboratorio del coinvestigador, que incluye SDS-PAGE, transferencia de membrana, incubación con anticuerpos y visualización con un sistema de imágenes de quimioluminiscencia. Toda la eficacia de los cebadores y la calidad de los anticuerpos se probarán antes de su uso. Tanto la PCR en tiempo real como el western blot se ejecutarán por triplicado.

Regulación epigenética del crecimiento y el metabolismo: los investigadores examinarán la metilación del ADN específica del sitio de los genes que estudios anteriores publicaron como susceptibles a exposiciones prenatales y que median el crecimiento a largo plazo y la programación metabólica de la descendencia mediante la secuenciación de bisulfito como se realizó anteriormente. . Brevemente, el ADN genómico se tratará con reactivo de bisulfito, después de lo cual la región genómica objetivo se amplificará mediante PCR. Se utilizará un sistema MassArray EpiTyper para cuantificar las secuencias metiladas. Los genes de interés incluyen LEP, SREBP1C y PPARG que intervienen en el metabolismo de las grasas, IGF2 que promueve el crecimiento, la hormona liberadora de corticotropina (CRH) que promueve la secreción de cortisol y el receptor de glucocorticoides (GR) que recibe señales de cortisol.