Suplementace cholinu na fetální růst u gestačního diabetu melitus

CÍLE STUDIE Specifický cíl 1: Zjistit vliv MCS během těhotenství na porodní hmotnost u GDM.

Specifický cíl 2: Stanovit vliv MCS na transport makronutrientů a epigenetické modifikace v placentě a pupečníkové krvi.

HYPOTÉZA

Cíl 1: Výzkumníci předpokládají, že cholinová skupina bude mít nižší porodní hmotnost a méně LGA novorozenců než cholinová skupina.

Cíl 2: Výzkumníci předpokládají, že cholinová skupina sníží placentární transport a zvýší metylaci DNA metabolických genů.

STUDOVAT DESIGN

Předměty: Bude přijata vhodná metodika odběru vzorků. Vyšetřovatelé budou postupně přijímat těhotné ženy s diagnózou GDM během druhého trimestru těhotenství. Bloková randomizace bude provedena na základě léčebných metod (tj. inzulínová terapie, perorální hypoglykemie nebo pouze dieta) k náhodnému rozdělení účastníků do intervenčních a kontrolních skupin. Nábor bude proveden pomocí následujících metod: (i) studijní letáky budou vyvěšeny na prenatální klinice; (ii) vyšetřovatelé určí těhotné ženy, které jsou potenciálně způsobilé, na základě přezkoumání lékařských záznamů.

Kritéria způsobilosti: Kritéria pro zařazení zahrnují těhotné ženy s GDM před 28. týdnem těhotenství. GDM je diagnostikována pomocí 2-krokového procesu: glykémie vyšší než 140 mg/dl cut-off po 50 g bez lačnění 1 hodinové a 100 g 3hodinové orální glukóze. Těhotné ženy se mohou zúčastnit, pokud mluví anglicky nebo španělsky, jsou starší 18 let, mají jednočetné těhotenství, mají v úmyslu porodit své děti v ústavu a nesplňují žádnou z podmínek uvedených v kritériích pro vyloučení. Kritéria vyloučení zahrnují již existující hyperglykémii, diabetes, kardiovaskulární stavy a onemocnění jater před těhotenstvím. Pacienti se mohou rozhodnout zúčastnit se studie a nedarovat biopsii své placenty nebo pupeční šňůry. Pacienti, kteří si přejí darování nebo skladování kmenových buněk, nebudou moci darovat biopsii své placenty nebo pupeční šňůry. Tito pacienti nebudou vyloučeni z primární analýzy.

Postupy návrhu a sběru dat:

Veškerá interakce s účastníky bude probíhat v porodní nemocnici, zatímco analýzy vzorků budou probíhat na kolegiu, kde se nachází laboratoř spoluřešitele. Koordinátor studie, zaměstnaný spoluřešiteli (Brooklyn College), nebude mít přístup k datům ani je nebude ukládat na dálku a veškerý sběr a analýza dat bude probíhat v areálu nemocnice.

Zkoušející získají písemný informovaný souhlas od těhotných žen před vstupem do studie. Randomizaci provede lékárna poté, co pacient podepíše souhlas. Půjde o blokovou randomizaci 6 pacientů. Po randomizaci poskytnou vyšetřovatelé účastníkovi intervenční skupiny cholinové doplňkové pilulky obsahující 500 mg cholin bitartrátu (235 mg cholinu, Douglas Lab). Účastník bude konzumovat 2 pilulky denně, aby získal 470 mg cholinu po dobu 8 týdnů. Doporučený příjem cholinu ve formě Adekvátního příjmu (AI) je 450 mg/den pro těhotné ženy a Tolerable Upper Intake Level (UL) je 3500 mg/den. Protože méně než 10 % těhotných žen dosáhne AI příjmu cholinu a horní kvartil příjmu cholinu je pod 900 mg/d. Dávka, kterou výzkumníci poskytují plus obvyklý příjem cholinu u těchto těhotných žen, bude spadat mezi AI a UL, tj. dostatečná, ale nepřesahující limit. Účastníci v kontrolní skupině dostanou placebo. Obě skupiny dostanou také standardní prenatální multivitaminy. Vyšetřovatelé poskytnou účastníkům zásobu doplňků na 5 týdnů a během příští návštěvy ověří jejich dodržování denními kontrolními záznamy o spotřebě suplementů a počtu zbývajících pilulek.

Účastníci se dostaví na celkem 3 návštěvy v době běžné klinické péče. První návštěva bude mezi 24. a 28. týdnem těhotenství, kdy zkoušející zaregistrují účastnice, druhá návštěva bude mezi 28. a 32. týdnem těhotenství a třetí návštěva bude mezi 32. a 36. týdnem. Vyšetřovatelé shromáždí základní dotazník při první návštěvě (přibližně 20 minut), po první návštěvě provedou 3denní opakování diety (přibližně 20 minut, každá), zkontrolují aktuální hmotnost a při všech návštěvách odeberou 20 ml vzorků krve. Při porodu vyšetřovatelé odeberou od účastníků vzorky placenty a pupečníkové krve.

Základní dotazník: Dotazník obsahuje demografické a lékařské informace, jako je věk, datum porodu, etnická příslušnost, parita, rodinný stav, úroveň vzdělání, povolání, příjem domácnosti, zdravotní pojištění, užívání návykových látek, užívání léků, výživový doplněk, rodinná anamnéza chronických onemocnění, a vlastní hmotnost před otěhotněním.

Hodnocení diety: Tři 24hodinové stažení stravy, 2 ve všední dny a 1 o víkendu, obdrží od každého účastníka vyškolený výzkumný asistent (RA) prostřednictvím telefonátů po prvních návštěvách, aby se kvantifikoval příjem cholinu ve stravě. Bude použita víceprůchodová metoda Harnacka a kolegů. RA zaznamená identifikaci potraviny, množství, specifikaci ingrediencí, způsob přípravy a zadá data do softwaru Nutrition Data System for Research (NDSR) pro analýzu příjmu cholinu. RA se také zeptá účastníků na jejich fyzickou aktivitu (PA) za posledních 24 hodin pomocí nástroje PA znovu.

Antropometrická měření a odběr krve: Vyšetřovatelé během návštěv změří váhu a výšku účastníků pomocí lékařské váhy s mechanickými tyčemi pro měření výšky. Aby se minimalizovaly rozdíly v koncentraci v plazmatických biomarkerech související s jídlem, budou účastníci poučeni, aby nekonzumovali jídlo alespoň 4 hodiny před ranním odběrem krve. Toto je standardní doporučení pro prenatální návštěvy a je považováno za bezpečné. Každému účastníkovi bude během návštěv vyšetřovatelem odebráno asi 20 ml žilní krve nalačno. Vzorky krve budou odebírány do jedné zkumavky pro odběr krve EDTA a jedné zkumavky se separátorem séra a centrifugovány, aby se získala plazma, buffy coat a sérum. Vzorky budou zpracovány a skladovány při -80oC v laboratoři, dokud nebudou použity pro analytická měření.

Řízení glukózy v krvi: Vyšetřovatelé získají informace o glykémii nalačno, hemoglobinu A1C, medikaci a inzulínové terapii z lékařských tabulek účastníků.

Informace o porodu a odběr vzorků při porodu: Účastníci telefonicky oznámí vyšetřovatelům, když budou přijati do porodního centra. Vyšetřovatelé jim také pošlou upomínky, protože se blíží jejich termíny splatnosti. Zdravotnický personál porodního centra navíc obdrží seznam jmen účastníků, takže bude také kontaktovat zkoušející, pokud se účastník přihlásí, když na místě není žádný z pracovníků studie. Jakmile se dítě narodí, vyšetřovatelé odeberou dvě zkumavky pupečníkové krve, aby získali sérum, plazmu a srst bílých krvinek. Vyšetřovatelé změří velikost a hmotnost placenty a zpracují placentu pomocí následující metody: biopsie placenty v plné tloušťce budou získány pomocí 6mm Keyesova děrovače a stabilizovány v RNAlater® (pro RNA), nebo zmrazeny v tekutém dusíku (pro jiné účely). Vzorky budou před použitím přepraveny do laboratoře spoluřešitele k dlouhodobému skladování při -80 °C.

Hodnocení dietního příjmu: Jak bylo uvedeno výše, údaje o dietním příjmu shromážděné z 3denního stažení stravy budou analyzovány softwarem NDSR. Denní příjem celkového cholinu se vypočte vynásobením frekvence konzumace součtem derivátů cholinu včetně volného cholinu, fosfatidylcholinu (PC), glycerofosfocholinu (GPC), fosfocholinu a sfingomyelinu každé potraviny. Denní příjem betainu (oxidačního produktu cholinu) se vypočte vynásobením frekvence konzumace a obsahu betainu v každé potravině. Průměrný denní příjem bude vypočítán jako průměrná denní spotřeba celkového cholinu a betainu během 3 dnů odstavení z diety.

Měření metabolitů cholinu: Volný cholin, betain a další deriváty cholinu [např. PC, GPC, lysofosfatidylcholin, dimethylglycin, trimethylaminoxid (TMAO)] budou měřeny v mateřské plazmě pomocí kapalinové chromatografie (LC)-hmotnostní spektrometrie (MS) /MS, jak bylo provedeno v předchozích studiích. Aby byla zajištěna přesnost a reprodukovatelnost dat, budou při extrakci použity stabilní izotopově značené standardy, všechny vzorky budou kvantifikovány na základě 6bodové standardní křivky a každý vzorek bude analyzován v duplikátech. Vzorky s koeficientem variace (CV) % vyšším než 5 % v rámci série nebo 10 % mezi sériemi budou opakovány.

Specifický cíl 2: Stanovit vliv MCS na transport makronutrientů a epigenetické modifikace v placentě a pupečníkové krvi. K dosažení tohoto cíle vědci určí expresi tukových a glukózových transportérů, stejně jako upstream regulační dráhy AKT/mTOR v placentárních biopsiích od účastníků. Výzkumníci budou měřit místně specifickou metylaci DNA klíčových genů souvisejících s růstem a metabolismem v placentě a pupečníkové krvi.

Analýzy markerů transportu makronutrientů v biopsiích placenty: Aby bylo možné analyzovat, jak může metabolismus cholinu souviset s placentárním transportem tuku a glukózy, použijí vědci PCR v reálném čase ke kvantifikaci množství mRNA metabolických genů a transportérů tuku a glukózy, jako jsou transportéry glukózy GLUT1 a GLUT3, geny související s metabolismem mastných kyselin, lipoproteinová lipáza (LPL), translokáza mastných kyselin (CD36), FATP a přenašeče aminokyselin SNAT2 a SNAT4. Množství příslušných proteinů, stejně jako fosforylace AKT a mTOR cílů 4EBP1 a S6K (indikující aktivaci dráhy) bude také měřeno westernovým přenosem, který se rutinně provádí v laboratoři spoluřešitele, která zahrnuje SDS-PAGE, membránový přenos, inkubace s protilátkami a vizualizace pomocí chemiluminiscenčního zobrazovacího systému. Před použitím bude testována veškerá účinnost primeru a kvalita protilátek. PCR v reálném čase i western blot budou prováděny v triplikátech.

Epigenetická regulace růstu a metabolismu: vyšetřovatelé budou zkoumat místně specifickou metylaci DNA genů, které byly publikovány předchozími studiemi jako náchylné k prenatální expozici a zprostředkovávající dlouhodobý růst a metabolické programování potomstva pomocí bi-sulfitového sekvenování, jak bylo dříve provedeno. . Stručně řečeno, genomová DNA bude ošetřena bisulfitovým činidlem, načež bude cílová genomová oblast amplifikována pomocí PCR. Ke kvantifikaci metylovaných sekvencí bude použit systém MassArray EpiTyper. Mezi sledované geny patří LEP, SREBP1C a PPARG, který zprostředkovává metabolismus tuků, IGF2, který podporuje růst, hormon uvolňující kortikotropin (CRH), který podporuje sekreci kortizolu, a glukokortikoidní receptor (GR), který přijímá signály kortizolu.