Mahdollisen rintasyövän biopankkitoiminta (PBCB)

A. Rintasyövän systeemisten uusiutumisten varhainen havaitseminen.

WP 1. Primaarisen kasvaimen analyysi.

Primaarisen kasvaimen ja etäpesäkkeiden analyysi (patologiaryhmä). Tässä työpaketissa sekä DNA:ta että RNA:ta 125 suuren riskin (Luminal-B) potilaan primaarisista kasvaimista analysoidaan seuraavan sukupolven sekvensoinnilla (NGS). Lisäksi tutkijat analysoivat myös DNA:ta ja RNA:ta saatavilla olevista metastaattisista leesioista (tällä hetkellä materiaalia saatavilla 3/8:lta), jotka ovat ilmaantuneet ja ilmestyvät tutkimusjakson aikana.

MiRNA ja mRNA profiloidaan käyttämällä PureLink™ miRNA Isolation Kit (Invitrogen), Dynabeads mRNA direct micro kit (Ambion) ja Ion total RNA-seq kit V2 (Life Technologies) Ion Proton NGS -instrumentissamme. Parillisten mRNA- ja mikroRNA-ilmentymisprofiilien bioinformaattisia analyyseja käytetään paljastamaan erilailla ilmentyviä mikroRNA:ita potilaiden välillä, joilla on ja joilla ei ole uusiutumista hoidon aikana. Nämä tiedot yhdistetään aiempiin tutkimuksiimme ja niitä käytetään tunnistamaan kohdeehdokkaat mikroRNA-analyysiin eksosomeissa ja TEP:issä.

Lisäksi NGS suoritetaan myös primaaristen kasvainten ja etäpesäkkeiden DNA:lle DNA-mutaatioiden varmentamiseksi erityisesti ER:ssä ja muissa tunnetuissa onkogeeneissä, mukaan lukien WP3:ssa tutkitut. DNA-sekvensointi suoritetaan käyttämällä Oncomine Comprehensive Assay -määritystä. Tämä on amplikonipohjainen lähestymistapa, joka analysoi hotspotin SNV:t, indelit ja CNV:t. Nämä analyysit antavat meille biologisen ymmärryksen ja taustatiedot jokaisesta yksittäisestä kasvaimesta, ja näitä aineistoja voidaan myös verrata äskettäin julkaistuihin tietoihin.

WP 2. Kiertävät kasvainsolut (CTC).

Kiertävät kasvainsolut (onkologiaryhmä) Kiertäviä kasvainsoluja rikastetaan ääreisverinäytteistä tiheyssentrifugoinnilla ja sitä seuraavalla leukosyyttien immunomagneettisella tyhjennyksellä. Onkologiaryhmä on äskettäin kehittänyt ja julkaissut uuden tyhjennysmenetelmän, nimeltään MINDEC (Multimarker Immunomagnetic Negative Depletion Enrichment of CTC), jolla on erinomaiset palautumis- ja rikastumisnopeudet. RNA ja DNA eristetään samanaikaisesti rikastetusta fraktiosta, jotta CTC voidaan havaita sekä RNA- että DNA-pohjaisilla lähestymistavoilla. Spesifisiä mRNA-markkereita, joilla on korkeat tasot kasvainsoluissa ja alhaiset tasot normaaleissa leukosyyteissä, esiamplifioidaan ja kvantifioidaan reaaliaikaisella PCR:llä CTC:iden korvikemarkkereina. Sekä epiteelispesifiset markkerit että epiteelin mesenkymaaliseen siirtymiseen liittyvät markkerit ovat osa merkkipaneelia. Tähän mennessä tutkijat ovat analysoineet 170 peräkkäistä verinäytettä suuremmasta PBCB-kohortista, joita on rikastettu MINDEC-menettelyllä ja löytänyt todisteita CTC:istä noin 20 prosentissa näytteistä (sekä matalan että korkean riskin potilaista), mikä rohkaisee meitä. jatkamaan tätä projektia. Tutkijat ovat myös analysoineet verinäytteitä 30 terveeltä vapaaehtoiselta naiselta vertailua varten. Kaikki 125 suuren riskin potilaasta kerätyt verinäytteet analysoidaan (noin 575 näytettä). CTC:iden läsnäoloa tai tasoa analysoiduissa näytteissä verrataan myöhemmin tunnettuihin prognostisiin tekijöihin, hoidon tehoon ja sairauden lopputulokseen.

WP 3. kiertävä kasvain-DNA (ctDNA).

Kasvainspesifisiä mutaatioita voidaan käyttää ctDNA:n markkereina, koska niitä ei ole normaaleissa soluissa ja normaalissa plasma-DNA:ssa. Onkologiaryhmä on äskettäin osoittanut ctDNA-mittausten kliinisen merkityksen haimasyövässä. Tutkijat mittaavat nyt ctDNA-tasoja suuren riskin rintasyöpäpotilaiden plasmanäytteistä kohdennetulla seuraavan sukupolven sekvensoinnilla. Äskettäin julkaistua "Oncomine rintojen cfDNA-testiä" (Thermo Fisher) käytetään mutaatioiden havaitsemiseen kymmenen geenin paneelissa, jotka usein mutatoituvat rintasyövässä. Määritys perustuu mallien molekyyliviivakoodaukseen ja mahdollistaa mutaatioiden toistettavan havaitsemisen 0,1 %:iin asti kontrollinäytteistä. Kun otetaan huomioon soluvapaan DNA:n (=cfDNA) alhainen pitoisuus plasmassa (tyypillisesti 10 ng/ml verta), 0,1 %:n herkkyyttä pidetään riittävänä. Sekvensointi suoritetaan Ion Proton NGS -instrumentillamme (Life Technologies). Tässä työryhmässä analysoidaan 125 suuren riskin potilaan ennen leikkausta otettu verinäyte ja vuosittaiset seurantanäytteet. Verinäytteet 30 terveeltä vapaaehtoiselta naiselta on jo kerätty, ja ne analysoidaan vertailua varten.

Kasvainspesifisten mutaatioiden esiintyminen ja taso analysoidaan suhteessa hoidon tehoon ja taudin lopputulokseen. Primaarisen kasvaimen biopsian ja plasmanäytteiden mutaatioprofiilia verrataan mahdollisen heterogeenisyyden paljastamiseksi. Lisäksi ctDNA:n mutaatioprofiilin pitkittäisiä muutoksia verrataan taudin kehittymiseen, jotta voitaisiin mahdollisesti valaista biologisia mekanismeja, jotka aiheuttavat hoitoresistenssiä tai myöhäisiä taudin uusiutumista.

WP 4. microRNA (miRNA)

Kiertävä mikroRNA eksosomeista ja TEP:istä (patologiaryhmä) Kokonais-RNA eristetään eksosomeista ja TEP:t verinäytteistä, jotka on otettu ennen hoitoa ja sen aikana. Tutkijat ovat äskettäin kehittäneet menetelmiä kokonais-RNA:n eristämiseksi eksosomeista (käyttäen exoRNeasy seerumi Plasma kit (Qiagen) ja miRCURY RNA isolation kit (Exiqon)) ja TEP:istä. Mainittua protokollaa käyttäen kokonais-RNA eksosomeista on jo eristetty kaikilta 125 suuren riskin potilaalta ensimmäisellä käynnillä/ennen hoitoa, lisäksi näiden potilaiden viimeisistä verinäytteistä eristetään kokonais-RNA sekä eksosomeista että TEP:istä. Lisäksi eristetylle RNA:lle tehdään mikroRNA-profiili käyttäen putkilinjaa ja alustaa, joka on jo perustettu Ion Proton -instrumentillemme. Näitä profiileja verrataan primaarisen kasvaimen (WP1) mRNA-miRNA-profiilien ja ennen hoitoa otettujen näytteiden bioinformaattiseen analyysiin. MikroRNA:ta, jota ei ole kudosnäytteessä ja/tai verinäytteessä ennen hoitoa, mutta esiintyy veressä juuri ennen uusiutumisen ilmaantumista, voidaan jäljittää jälkikäteen aikaisemmista verinäytteistä, jotta voidaan nähdä, kuinka herkkiä nämä mikroRNA:t ovat hoidon ennustamisessa. vastus. TEP:iden mikroRNA-profiilia verrataan eksosomien mikroRNA-profiiliin ja primaarisen kasvaimen mRNA-miRNA-profiileihin (WP1, jotta nähdään, heijastavatko TEP:t kasvainta ja onko niillä potentiaalia ennustaa uusiutumista.

WP 5. Aineenvaihdunta

Metabolomiikka tutkii pieniä molekyylejä, jotka sisältävät solujen aineenvaihdunnan substraatteja, välituotteita ja lopputuotteita, kuten aminohappoja, sokereita ja pieniä orgaanisia happoja. Syöpäsolujen metabolinen tila on olennaisesti muuttunut normaaleihin soluihin verrattuna, mitä voidaan hyödyntää diagnostisiin tarkoituksiin. Kasvainkudoksesta saadut spesifiset metaboliset allekirjoitukset tarjoavat lisätietoa rintasyövän alatyyppien määrittämiseen ja lopputuloksen ennustamiseen1. Esimerkiksi kasvaimen laktaatti- ja glysiinitasot liittyvät huonoon ennusteeseen potilailla, joilla on estrogeenireseptori (ER) positiivinen syöpä. Primaaristen kasvainten aineenvaihdunta-analyysit ovat myös osoittaneet ennakoivaa arvoa paikallisesti edenneen sairauden potilaiden neoadjuvanttihoidossa.

Kierrettävien metaboliittien on myös osoitettu tarjoavan prognostista tietoa operoitavissa olevasta rintasyövästä ja jakavan riskiä entisestään olemassa olevien geneettisesti määrättyjen riskikategorioiden sisällä. Tärkeää on, että metaboliset muutokset voivat johtua suoraan tai epäsuorasti mikrometastaattisesta sairaudesta primaarisen kasvaimen sijaan. Äskettäin tutkijat ovat osoittaneet, että systeemiset laktaatti- ja pyruvaattitasot ennustavat huonompaa lopputulosta potilailla, joilla on operoitavissa oleva ER-positiivinen rintasyöpä. Kasvaimen viereinen kudos ja immunologiset vasteet voivat myös vaikuttaa muuttuneeseen metabolomiseen profiiliin. On myös näyttöä siitä, että aineenvaihdunnan profilointia voidaan käyttää potilaiden seurantaan joissakin syöpissä, vaikka rintasyövän osalta tällaista näyttöä ei vielä ole. Siksi tutkijat aikovat selvittää, onko leikkauksen jälkeinen seuranta veren metabolisen profiloinnin avulla hyödyllistä rintasyövän uusiutumisen varhaisessa havaitsemisessa.

WP 6. Integratiivinen molekyyliseuranta uusiutumisen havaitsemiseen

Uusi teknologia on mullistanut kliinisistä näytteistä saatavan biologisen tiedon tason, jota edustavat uudet "omics"-termit genomiikka, transkriptomiikka, metabolomiikka jne. Tällaisten suurten tietokokonaisuuksien saatavuus, jopa julkisesti, on rohkaissut kehittämään integroivia menetelmiä, joilla voidaan poimia elintärkeää tietoa useista yhdistetyistä tietolähteistä. Tällaiset lähestymistavat ovat paljastaneet yllättäviä uusia yhteyksiä omics-tietosarjojen välillä, esimerkkinä soluttoman DNA:n fragmentaation ja geenin ilmentymisen välinen yhteys46. Näin ollen tietomme rintasyövästä on myös laajentunut integroivilla lähestymistavoilla, mikä on johtanut taudin kokonaisvaltaiseen ymmärtämiseen. Esimerkiksi rintasyöpien prognostista alaluokitusta on jalostettu ja uusia kasvainspesifisiä antigeenejä tunnistettu. Integroidulla molekyylitiedolla on jopa osoitettu olevan suurempi ennustevoima kuin erillisillä molekyylitasoilla rintasyövässä. Näin ollen nykyisessä hankkeessa suunnitellaan perifeeristen verinäytteiden geneettisten (ctDNA), transkriptomisten (miRNA) ja metabolomien datatasojen yhdistettyä analyysiä niiden yhteisen biomarkkeripotentiaalin maksimoimiseksi operoitavissa olevassa rintasyövässä.

Otoskokolaskelmat.

Tutkijat suorittivat näytekokolaskelmat SPSS Sample Power -ohjelmistolla. Nämä laskelmat osoittivat, että 125 korkean riskin potilasta pitäisi riittää antamaan log rank -testiteho 80 %, kun testataan ctDNA/CTC-havainnon ennustearvoa ennen leikkausta. Otoskokolaskelmat perustuivat siihen oletukseen, että keskimääräinen 5 vuoden eloonjäämisaste korkean riskin ryhmässä on 90 %, kun taas ctDNA/CTC-positiivisissa ja negatiivisissa alaryhmissä se on 75 % ja 95 %. Arvioidusta 125 potilaasta 30:n oletettiin olevan ctDNA/CTC-positiivisia ja 95 negatiivisia.

--------------------------------------------------- --------------------------------------------------- -----

B. Parantaa tamoksifeenin lääkevalvontaa rintasyövän hoidossa

Noin 75 % kaikista rintasyövistä kuuluu luminaalisiin alatyyppeihin, jotka ilmentävät hormonaalisia reseptoreita estrogeenireseptoria ja progesteronireseptoria. Näitä potilaita hoidetaan estrogeenilääkkeillä; tamoksifeeni ja/tai aromataasi-inhibiittorit. Kaksi aktiivisinta tamoksifeenin metaboliittia ovat Z-4OHtam ja Z-4OHNDtam (Z-endoksifeeni), joilla on 30-100 kertaa suurempi affiniteetti ER:ään kuin tamoksifeenilla. Nämä metaboliitit muodostavat viime kädessä estävän vaikutuksen ER-tasolla, jonka tarkoituksena on poistaa mikrometastaattinen sairaus, ja ne ovat vastuussa parantuneesta eloonjäämisestä tämän systeemisen adjuvanttihoidon käyttöönoton jälkeen. Näiden metaboliittien suora mittaus ohittaa kaikki häiriöt, jotka johtuvat CYP2D6-aktiivisuuden monimuotoisuudesta, toisin sanoen vaihtoehtoisista aineenvaihduntareiteistä, lääkkeeseen sitoutumisesta ja lääkkeiden yhteisvaikutusten estämisestä. Uusi LC/MS-MS-metodologiamme ottaa huomioon kaikki edellä mainitut muuttujat ja tarjoaa toiminnallisen raportin aktiivisten tamoksifeenin metaboliittien seerumipitoisuudesta yksittäisellä potilaalla. Tällä menetelmällä voidaan myös erottaa endoksifeenin ja 4-OHtamin inaktiiviset ja aktiiviset isomeerit, jotka ovat tamoksifeenin aktiivisimpia ER:tä estäviä metaboliitteja. Yhteistyössä Oslon Breast Cancer Research Groupin kanssa tutkijat ovat äskettäin osoittaneet retrospektiivisessä havainnointitutkimuksessa, että potilailla, joiden seerumin Z-4OHtam-pitoisuus on alhainen < 3,26 nM tai Z-endoksifeeni < 9,00 nM (noin 12 %:lla kaikista potilaista), on merkittävää vaikutusta. huonompi rintasyöpäspesifinen ja kokonaiseloonjääminen kuin potilailla, joiden seerumipitoisuus ylittää nämä kynnysarvot (mukautettu HR = 4,3; CI95 = 1,9-13,6) (punaiset käyrät kuvassa 4). Potilailla, joilla oli erittäin paljon näitä metaboliitteja (noin 12 % potilaista), ei ollut rintaspesifisiä päätepisteitä. Nyt tutkijoiden on validoitava tämä löytö riippumattomissa potilasmateriaaleissa. Jos tämä validoidaan, siitä on suoraa kliinistä hyötyä 25 %:lle ER + rintasyöpäpotilaista, jotka suunnittelevat adjuvanttia tamoksifeenihoitoa. Tällainen terapeuttinen lääkkeiden seuranta (TDM) voisi tunnistaa riskipotilaat, joilla on riittämätön aktiivisten tamoksifeenin metaboliittien taso. Tämä voi johtaa annoksen suurentamiseen tai siirtymiseen vaihtoehtoiseen endokriiniseen hoitomuotoon näillä potilailla. Potilaat, joilla on erittäin korkeat metaboliittipitoisuudet, voivat jatkaa tamoksifeenin käyttöä, eikä heidän tarvitse vaihtaa aromataasinestäjään.

Siten TDM voi osoittautua paradigmaattiseksi muutokseksi ER-positiivisen rintasyövän endokriinisen tamin hoidossa. Tärkeää on, että etäisyys "penkistä sänkyyn" tässä tutkimuksessa on erittäin lyhyt viimeaikaisten löydöstemme, käyttökelpoisen menetelmän ja yli 30 vuoden kokemuksen tamoksifeenin käytöstä kliinisissä olosuhteissa ansiosta.

--------------------------------------------------- --------------------------------------------------- -----

C. Kasvaimen mikroympäristö rintasyövässä - rasvaisen stroman immuuni-infiltraatio ja vuorovaikutus kasvaimen kanssa kasvuvyöhykkeellä

Taustaa: Rintasyöpä on edelleen naisten yleisin syöpätyyppi länsimaissa, Norja mukaan lukien. Norjassa diagnosoidaan vuosittain noin 3500 uutta rintasyöpäpotilasta. Viimeisten 50 vuoden aikana rintasyövän ilmaantuvuus Norjassa on yli kaksinkertaistunut. Mielenkiintoista on, että samalla ajanjaksolla ylipaino ja lihavuus ovat lisääntyneet hälyttävästi. Rintasyövän kasvainten molekyylialatyypit ovat parantaneet ymmärrystä sen luontaisesta biologiasta. Tämä on avannut henkilökohtaisemman lähestymistavan hoitoon ja parantanut rintasyöpäpotilaiden tuloksia viimeisten 20 vuoden aikana.

Rintasyövän diagnostiikka koostuu nykyään molekyylialatyypityksen lisäksi stagingista (TNM-luokitusjärjestelmän kautta) ja patologin mikroskooppisesta tutkimuksesta. Kasvaimen mikroympäristön arvioinnin ennustearvosta on yhä enemmän näyttöä (esim. tuumoriinfiltroivat lymfosyytit (TIL)) osana rintasyövän diagnostiikkaa, mutta tätä ei toistaiseksi ole toteutettu kliinisessä käytännössä. Suuri määrä TIL:itä liittyy vahvasti hyvään ennusteeseen potilailla, joilla on kolminkertaisesti negatiivinen rintasyöpä, mutta ne eivät ole osoittaneet tällaista korrelaatiota luminaalisessa rintasyövässä. Rintojen rasvakudoksen makrofagit erottuvat kahdeksi erilliseksi fenotyypiksi, jotka luokitellaan usein M1:ksi ja M2:ksi, ja jälkimmäinen lisääntyy rintasyövässä. M1 hyökkää ja fagosytoi syöpäsoluja, kun taas M2:lla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia ja sillä on osoitettu olevan kasvainta edistäviä toimintoja.

Tämä projekti lisää tietämystämme primaarisen rintakasvaimen ja immuunisolujen infiltraation välisestä vuorovaikutuksesta tuumoriperäisessä rasvakudoksessa. Löydökseemme korreloivat molekyylitason rintasyövän alatyyppeihin, kasvaimen läheisyyteen, proliferaation markkereihin ja viime kädessä kliiniseen lopputulokseen. Tutkijat arvioivat, että tämä tieto tarjoaa uusia ennustekohteita immuunivastetta moduloivalle adjuvanttisyövän hoitoon. Tässä tohtoriprojektissa on kolme toisiinsa liittyvää työpakettia (WP), joiden perimmäisenä tavoitteena on tunnistaa tulehdusmarkkerit rintasyövän adjuvanttihoidon kliinisen arvioinnin kannalta rintasyövän adjuvanttihoidon yhteydessä. WP 1:ssä ja 2:ssa kartoitetaan tuumoriperäisen rasvakudoksen fenotyyppistä ja genomista maisemaa, ja WP 3:ssa tutkimukset selvittävät, voidaanko tällä tiedolla ennustaa kliinisiä tuloksia.

Hanke perustuu Haukelandin yliopistollisen sairaalan (HUH) ja Stavangerin yliopistollisen sairaalan (SUH) vahvaan alueelliseen yhteistyöhön. Meneillään olevaa hanketta varten tutkimukset ovat keränneet systemaattisesti rasva- ja kasvainkudoksia 30 peräkkäiseltä rintasyöpäpotilaalta, joille tehdään SUH:n mastektomia. Kirurgiset rintanäytteet toimitetaan viipymättä patologille, joka morfologisessa valvonnassa ottaa näytteen asiaankuuluvasta kudoksesta primaarisen kasvaimen invasiivisesta eturintamasta ja ytimestä (0,5x1x1 cm). Patologi kerää ja vahvistaa morfologisesti myös kaukaisesta kontralateraalisesta kvadrantista saadut kontrollit normaalista rintakudoksesta (2000 mg). Kudos kerätään kaksoispareina. Yksi näytteistä pikapakastetaan välittömästi nestetypessä säilytystä varten, kun taas toinen puoli jokaisesta parista säilötään formaliinissa ja kiinnitetään parafiiniin (FFPE). Lisäksi kolme paria rasvakudosnäytteitä (kukin 1x1x1 cm), joiden etäisyys kasvaimen rajasta kasvaa, muodostaa rasvakudoksen gradientin kasvainalueen invasiiviselta etupuolelta. Kerätyt gradientit myös pikapakastetaan välittömästi nestetypessä ja puolet kustakin parista varastoidaan FFPE:nä. Tutkijat ovat tehneet pilottitutkimuksen, jossa on varmistettu riittävä RNA-saanto jäädytetyistä kudosnäytteistä RNA-sekvensointia varten.

Kudos kerätään osana yleistä tutkimusbiopankkia, Prospective Breast Cancer Biobank (PBCB) (REK# 2010/1957), meneillään olevaa biopankkiprojektia.

Retrospektiivinen Stavanger-kohortti koostuu kaikista rintasyöpäpotilaista, joilla on diagnosoitu ensimmäinen invasiivinen rintasyöpä Stavangerin yliopistollisen sairaalan patologian osastolla vuosina 1993-2004. Koska SUH on alueen ainoa sairaala, tämä on todellinen populaatiopohjainen biopankki, johon on jo sisällytetty klinikopatologisia tietoja, kuten: luokittelu, vaihe, TNM, hoito- ja proliferaatiomarkkerit (Ki-67, PPH3/MAI); viimeinen kliininen seuranta tehtiin vuonna 2016.

Tutkimuksissa on neljä päähypoteesia, jotka liittyvät tulehdukseen ja immuunisolujen infiltraatioon rintasyövässä:

1. Tuumorirajaa lähellä olevassa rinnakkaiskasvaimen rasvakudoksessa on lisääntynyt tulehdus ja immuunisolujen infiltraatio.
2. Tulehdus ja immuunisolujen infiltraatio heikkenevät, kun etäisyys kasvaimen rajasta kasvaa.
3. Tulehduksissa ja immuunisolujen infiltraatiossa on eroja rintasyövän eri alatyyppien välillä (Luminal A, Luminal B ja Basalin kaltaiset).
4. Lisääntynyt tulehdus ja immuunisolujen infiltraatio korreloivat haitallisten kliinisten tulosten kanssa (esim. taudin uusiutuminen).

4.1 TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU, MENETELMÄT JA ANALYYSIT

Tutkimuksissa on neljä päähypoteesia, jotka liittyvät tulehdukseen ja immuunisolujen infiltraatioon rintasyövässä:

1. Tuumorirajaa lähellä olevassa rinnakkaiskasvaimen rasvakudoksessa on lisääntynyt tulehdus ja immuunisolujen infiltraatio.
2. Tulehdus ja immuunisolujen infiltraatio heikkenevät, kun etäisyys kasvaimen rajasta kasvaa.
3. Tulehduksissa ja immuunisolujen infiltraatiossa on eroja rintasyövän eri alatyyppien välillä (Luminal A, Luminal B ja Basalin kaltaiset).
4. Lisääntynyt tulehdus ja immuunisolujen infiltraatio korreloivat haitallisten kliinisten tulosten kanssa (esim. taudin uusiutuminen).

WP 1: IMMUUNITSOLUTUKSIEN MORFOLOGINEN JA GENOMINEN KARTTAUS RINTASyöVÄN RASVAKUDOKSESSA

Tausta: Tulehdus on tärkeä tuumorin kehittymisen edistäjä (16). Rintasyövän lähellä olevan rasvakudoksen on osoitettu lisäävän immuunisolujen infiltraatiota, mutta ei vielä tiedetä, miten tämä liittyy molekyylien alatyyppeihin ja/tai kasvaimen läheisyyteen. Tutkimuksissa arvioidaan IHC- ja RNA-sekvensoinnilla rintasyöpää ympäröivän rasvakudoksen tulehdustasoa, immuunisolujen infiltraatiota ja immuunigeenin ilmentymisen allekirjoituksia.

Suunnittelu: Prospektiivinen eksploatiivinen tutkimus Potilaat, materiaali ja teholaskenta: Prospektiivisesti kerätyistä rinnanpoistonäytteistä kerätään rasvakudosta. Kudosnäytteitä kerätään kolmesta eri molekyylialaryhmästä (Luminal A, Luminal B ja Basal kuten rintasyöpä), 10 kustakin ryhmästä. Ydinbiopsiat kerätään gradienttiin, jonka etäisyys kasvaimen rajasta kasvaa (kuva 1). 1). Norwegian Genomics Consortium (NGC) on vahvistanut, että tiettyjen rintasyövän alatyyppien valintaan perustuvat otoskoot ovat riittävät tilastolliseen tehokkuuteen.

Menetelmät: Formaliinilla kiinnitetyn kudoksen objektilasit kasvaimesta, invasiivisesta etukudoksesta ja rasvakudoksesta (kuva 1) värjätään käyttämällä IHC:tä ja immuunisolujen vasta-aineita (koko immuunisolut, CD45; T-solut, CD3, CD8, FoxP3; myeloidisolut, CD68 , HLA-DR). Objektilasit arvioidaan mikroskopialla ja tulokset korreloidaan rintasyövän molekyylialaryhmiin, lokalisaatioon suhteessa kasvaimeen ja proliferaatiomarkkereihin (ts. Ki67, PPH3 ja MAI). Samanaikaisesti tutkimukset suorittavat RNA-sekvensointia jäädytetyille kudoksille, jotka on kerätty samoista kudosnäytteistä kuin edellä on kuvattu. RNAseq-tiedoissa käytetään useita analyysimenetelmiä. Lukuun ottamatta tietojen analysointia, erityisiä analyysialgoritmeja, mukaan lukien muun muassa immuunisolujen dekonvoluutio (ABIS, CIBERSORTx) ja tarkemmin sanoen kasvaimen immuuniallekirjoituksia (TIP-analyysi).

Odotettu tulos: Tutkimukset odottavat löytävänsä lisääntynyttä tulehdusta ja immuunisolujen infiltraatiota tuumoriperäisessä rasvakudoksessa ja muuttunutta tulehduksellisten geenien ilmentymistä, joita tutkimukset voivat edelleen tutkia WP 2:ssa.

WP 2: ARVIOINTI JUXTA-TUUMOURAL RASVAKUDOKSESSA TULEKSELLISESTA REAKTIOT RINTASyövässä IMMUNOHISTOKEMIAN JA KUVAUSMASSASYTOMETRIAN KÄYTTÖÖN.

Tausta: Rintasyöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa ympäröivän kudoksen kanssa ja aiheuttavat tulehdusta ja immuunisolujen tunkeutumista kasvaimeen ja rasvakudokseen. Kuvausmassasytometria on osoittanut, että immuunisolujen infiltraatio kasvaimissa korreloi ennusteen kanssa, mutta toistaiseksi ei ole olemassa tutkimuksia, joissa tutkittaisiin, osoittaako kasvainta ympäröivä rasvakudos myös immuunisolujen infiltraatiota. Siksi tutkimukset tutkivat rintasyöpäkasvaimia ympäröivää rasvakudosta Hyperion™ Imaging Mass Cytometry -menetelmällä.

Suunnittelu: Prospektiivinen eksploatiivinen tutkimus Potilaat, materiaali- ja teholaskenta: Kudosnäytteet kerätään 30 prospektiivisesti hankitusta mastektomianäytteestä, joissa on kolme erilaista molekyylialaryhmää (Luminal A, Luminal B ja Basal kuten rintasyöpä), 10 kustakin ryhmästä. Rasvakudos kerätään gradientissa pois tuumorista ja kontralateraalisesta kvadrantista kontrollinäytteeksi (kuva 1). 2). 30 potilaan otoskoon katsotaan olevan riittävä tämän tyyppiseen esiselvittävään tutkimukseen.

Menetelmät: Hyperion™ IMC -paneeli, jossa on jopa 50 ainutlaatuista vasta-ainetta, kehitetään perustuen jo olemassa olevaan ja validoituun paneeliin, joka on saatavilla UoB:n ydinlaitoksessa ja jota tutkijat ovat aiemmin käyttäneet menestyksekkäästi muissa projekteissa. Käytettävissä olevaa paneelia laajennetaan edelleen WP 1:n havaintojen perusteella, ja se validoidaan ensin "ei-välttämättömillä" rintakudosnäytteillä ennen käyttöä edellä kuvatuissa tutkimusnäytteissä. Hyperion™ IMC:n avulla tutkimukset aikovat analysoida tulehdusreaktion tasoa tuumoriperäisessä rasvakudoksessa. IMC-tiedot analysoidaan histoCAT+:lla, MAV:lla ja FlowJo:lla (käytetään tyypillisesti virtaussytometriatietojen analysointiin, mutta ne soveltuvat myös erittäin korkeaparametriseen kuvantamisanalyysiin). Lisäksi tutkimukset osaavat hyödyntää WP 1:ssä tunnistettuja tunnettujen ja uusien tekijöiden geeniekspressiodataa ja visualisoida, onko ilmentyminen yleistynyt vai osioitunut rasvakudoksessa. Kontrollina käytetään normaalia rasvakudosta kontralateraalisesta kvadrantista. Jotta BC:n vaikutusta eri molekyylialatyyppien yhdystuumoraalisen rasvakudoksen tulehdukseen voitaisiin tutkia tarkemmin, tutkimuksissa on tarkoitus värjätä kudosta kolmesta kasvaimesta ulottuvasta kudossegmentistä, jotta voidaan määrittää, riippuvatko tasot etäisyys kasvaimesta tai molekyylialatyypistä (kuvio 1). Tumoraalisen rasvakudoksen tulehdus arvioidaan myös morfologisesti käyttämällä IHC:tä. Tämä antaa meille mahdollisuuden valita kiinnostavat alueet tutkittavaksi IMC:n avulla.

Odotettu tulos: Tutkimusten odotetaan löytävän lisääntynyttä tulehdusta ja immuunisolujen infiltraatiota rasvakudoksesta kasvaimen lähellä ja tunnistavan uusia biomarkkereita rasvakudoksesta, mikä mahdollistaa kliinisen merkityksen tutkimisen WP 3:ssa.

WP 3: JUXTA-TUUMOURAL RASVAKUDOKSESSA TULEKSEVA REAKTI RINTASyövässä JA KLIINISET TULOKSET.

Tausta:

Immunohistokemia on rintasyövän diagnostiikan kulmakivi ja se toimii päämenetelmänä rintasyövän molekyylien alaryhmien ja proliferaatiomarkkerien, kuten Ki-67, tunnistamisessa. Tämä on välttämätöntä määritettäessä, mikä hoito-ohjelma sopii parhaiten kullekin potilaalle. Kasvainkudoksen heterogeenisyys (sekä kasvainsolut että tunkeutuvat immuunisolut) on yhdistetty kliinisen lopputuloksen eroihin, mutta vielä ei tiedetä, koskeeko sama kasvainta ympäröivää rasvakudosta. Siten tutkimukset tutkivat rintasyöpärasvakudosta tulehduksen ja immuunisolujen infiltraation varalta ja korreloivat tämän kliinisen tuloksen kanssa rintasyöpäpotilailla.

Suunnittelu: Kliininen havainnointitutkimus

Potilaat ja menetelmät: Biopankkiin on kertynyt 3500 rintasyöpäpotilasta, joiden seuranta-ajan mediaani on 15 vuotta. Suuri valikoima näiden potilaiden kudosnäytteitä arvioidaan rasvakudoksen immuunisolujen ja WP 1:ssä ja 2:ssa IHC:n avulla löydettyjen biomarkkerien suhteen. Näytteet kerrostetaan kolmeen ryhmään molekyylien alaryhmien mukaan (esim. Luminal A, Luminal B ja Basal kuten rintasyöpä). Kudoslasit analysoidaan ja tulokset korreloivat potilaslehtien kliinisten tulosten kanssa (pääsy lehtiin on jo REK:n hyväksymä). Coxin suhteellista riskisuhdetta ja log-rank-testiä käyttämällä tutkimukset arvioivat lisääntyneen tulehduksen vaikutusta rasvakudoksessa potilaan eloonjäämiseen.

Tehon laskeminen: Tutkimukset arvioivat uusiutumisvapaan eloonjäämisen eron testitehoa potilaiden välillä, jotka olivat positiivisia ja negatiivisia rinnakkaisen kasvaintulehduksen suhteen arvioituna IHC:llä ja IMC:llä. Vaikutusmitta on Cox-regressiomenetelmällä laskettu vaarasuhde (HR). Esimerkki: 1000 potilasta, joiden uusiutumisaste on 15 %, on luonut vähintään 150 päätepistettä. Jos tulehdusaste on 20 %, tutkimuksilla on 80 %:n kyky havaita eloonjäämisero, jonka riskisuhde (HR) on 1,80 tai suurempi.

Odotettu tulos: Tämä viimeinen työpaketti on suunniteltu todistamaan periaatteesta, että on mahdollista sisällyttää tuumoriperäisen rasvakudoksen histologinen tutkimus osaksi rintasyövän diagnostiikkaa. Pidemmällä tähtäimellä tutkimukset pyrkivät tunnistamaan uusia spesifisiä immuunitunkeutumisen biomarkkereita rasvakudoksessa, jotka korreloivat rintasyöpäpotilaiden haittavaikutuksiin. Sellaiset biomarkkerit voivat toimia ennakoivina työkaluina potilaiden tunnistamiseksi, jotka ovat kelvollisia anti-inflammatoriseen tai immuunijärjestelmää moduloivaan hoitoon.

--------------------------------------------------- ------------------------------------------------

D. Seuraa sivuvaikutuksia, elämänlaatua, masennusta, väsymystä ja työelämään osallistumista Taustaa

Rintasyövän hoidossa käytetään kaikkia leikkausta, kemoterapiaa, sädehoitoa ja erilaisia ​​kohdennettuja hoitovaihtoehtoja, kuten antiestrogeeni- ja anti-HER-2-hoitoa. Nämä hoitovaihtoehdot aiheuttavat kiusallisia sivuvaikutuksia sekä lyhyellä että pitkällä aikavälillä. Tärkeää on, että onkologisten hoitomuotojen ja rintasyöpäpotilaiden subjektiivisten terveysvalitusten välillä on hiljattain löydetty monimutkaisempia yhteyksiä. Väsymys-, ahdistuneisuus- ja masennuspisteet ovat luultavasti toiminnallisia tuloksia kokonaishoitotaakasta. Syövänvastaisella hoidolla on myös merkittävä vaikutus syövästä selviytyneiden elämänlaatuun ja sosiaalisiin näkökohtiin, mikä ulottuu myös työelämään. Sairausloma (SL) viiden vuoden kuluttua rintasyöpädiagnoosista riippuu enemmän sosiaalisista tekijöistä kuin sairaudesta (2). Näin ollen rintasyöpä iskee naisia ​​kahdesti; ensin sairaustaakka ja sitten sosiaalis-taloudelliset huolet. Rintasyövästä selviytyneillä on lähes 3 kertaa suurempi riski saada työkyvyttömyyseläkettä (DP) verrattuna syöpävapaisiin potilaisiin retrospektiivisessä rekisteripohjaisessa tutkimuksessa (3). Tämä tutkimus perustui kuitenkin enimmäkseen hylättyihin onkologisiin hoito-ohjelmiin.

Tavoitteet

Tämän tutkimuksen tavoitteena on tunnistaa riskitekijät kehittyä pitkäaikaiseksi SL-, WAA- tai DP-vastaanottimeksi syvällisen kvalitatiivisen analyysin ja sekamenetelmän avulla kolmiomittaen PROM-tiedot, kliiniset/biologiset tiedot ja NAV-tiedot. NAV-tietojen käyttö päätepisteinä antaa arvokasta tietoa lääkäreille ja yleislääkäreille, jotka voivat optimoida seurantaa myös työelämään osallistumisen osalta. Siksi tutkijoilla on vankka tutkimussuunnitelma korkeiden SL-, WAA- ja DP-nopeuksien fisk-tekijöiden tunnistamiseksi. Viime kädessä tutkijat pyrkivät alentamaan rintasyövän yhteiskunnalle aiheuttamia taloudellisia kuluja.

Opintojen suunnittelu / materiaali ja menetelmät.

Tutkimussuunnitelma on havaintotutkimus, jossa tutkijat kartoittavat tässä tutkimuksessa rintasyövästä selviytyneiden korkean SL:n, WAA:n ja DP:n esiintymistiheyksiä ja hampaiden fisk-tekijöitä ajantasaisten hoito-ohjelmien avulla. Tutkijat noudattavat 4-vaiheista translaatiota:

1. Tutkijat tekevät ensin tutkivan kvalitatiivisen tutkimuksen, jossa käytetään dokumenttianalyysiä terveys- ja työelämäpolitiikasta Norjan kontekstissa, yhdistettynä empiirisiin tietoihin puolistrukturoiduista haastatteluista ja kohderyhmästä, jossa on 20 korkean riskin potilasta) analysoitavaksi temaattisesti. Tämän laadullisen projektin teoreettinen viitekehys on johdettu symbolisesta interaktionismista, jossa tavoitteena on merkityksen paljastaminen ja ymmärtäminen tietyissä yhteyksissä. Koska merkitykselliset sosiaaliset ja ammatilliset vuorovaikutukset ovat tärkeitä rintasyöpäpotilaiden psykososiaalisessa kuntoutuksessa, symbolinen interaktio on sopiva metodologinen viitekehys. Tämä laadullinen lähestymistapa luo lähestymistavan perusteet alla olevissa PROM-pohjaisissa ja NAV-tietokantasuuntautuneissa tutkimuksissa.

2. NAV-tiedot

   Tällä hetkellä tutkijat tekevät yhteistyötä varajohtaja Anneline Christine Teigenin ja vanhempi konsultti Günter Olsborgin kanssa NAV-Rogalandissa ja Norjan tilastokeskuksen (SSB) Mikrodata-osion kanssa. Tämän yhteistyön tavoitteena on hankkia lisää tietoa sosiaaliturvapalvelujen käytöstä rintasyöpäpotilaiden keskuudessa yhdessä NAV-Rogalandin asiantuntijoiden kanssa ja yhdessä SSB:n kanssa käyttää FD-trygd-tietokantaa luotettavan tulevan sosiodemografisen tiedon saamiseksi SL:istä (sekä lyhyistä että pitkistä). termi), WAA (World Assessment Allowance) (Arbeidsavklaringspenger) ja DP:t (molemmat aikarajoitetut

   ja elinikäinen) jokaiselle potilaalle tässä PerMoBreCan-tutkimuksessa.

3. Potilaiden raportoimat tulosmittaustiedot (PROM) saadaan lähtötilanteessa ja sen jälkeen vuosittain kaikilta PerMoBreCan-potilailta. PROM-tiedot koostuvat 1.HRQoL-instrumenteista (EORTC QLQ-C30, EORTC QLQ-BR23 ja FACT B), 2. Sairaalan ahdistuneisuus- ja masennusasteikko, HAD, 3. Väsymysinstrumentit Fatique Impact Scale, FIS; Väsymyksen vakavuusasteikko (FSS) ja VAS-väsymys, 4. Sivuvaikutuksia koskevat kyselylomakkeet, 5. Nivelkipukyselyt, 6. The Mishel Uncertainty in Illness Scale, MUIS; ja 7. Ruokatottumuskyselylomake ja 8.ROMA III -kyselylomake suolistovaivoja (IBD ja IBS).
4. Biomarkkerin tunnistaminen.

Kaikki tähän tutkimukseen osallistuvat potilaat seulotaan verenkierrossa olevien väsymykseen liittyvien biomarkkereiden perusteella. Nämä biomarkkerit ovat proteiinitasolla, geneettisen ilmentymisen tasolla ja myös epigeneettisellä tasolla. Pitkäaikainen miellyttävä yhteistyömme prof. Roald Omdal Stavangerin yliopistollisesta sairaalasta, joka on kliininen immunologi ja transaltionaalisen väsymyksen tutkija, on sitoutunut suorittamaan nämä analyysit tutkimuslaboratoriossaan.