Leendő Breast Cancer Biobanking (PBCB)

A. A mellrák szisztémás relapszusainak korai felismerése.

WP 1. Primer tumor elemzése.

Primer tumor és metasztázisok elemzése (Pathology csoport). Ebben a munkacsomagban 125 magas kockázatú (Luminal-B) beteg primer daganatából származó DNS-t és RNS-t egyaránt elemzik következő generációs szekvenálás (NGS) segítségével. Ezen túlmenően a kutatók elemezni fogják a rendelkezésre álló metasztatikus léziók DNS-ét és RNS-ét is (jelenleg 3/8-a áll rendelkezésre), amelyek megjelentek és megjelennek a vizsgálati időszakban.

A MiRNS-t és az mRNS-t a PureLink™ miRNA Isolation Kit (Invitrogen), a Dynabeads mRNA direct micro kit (Ambion) és az Ion total RNA-seq kit V2 (Life Technologies) segítségével profiláljuk az Ion Proton NGS műszerünkön. A párosított mRNS- és mikroRNS-expressziós profilok bioinformatikai analízisét használják fel a differenciáltan expresszálódó mikroRNS-ek feltárására a kezelés alatt álló és kiújulásos betegek között. Ezeket az adatokat összekapcsoljuk korábbi tanulmányainkkal, és felhasználjuk a mikroRNS-elemzés céljelöltjeinek azonosítására exoszómákban és TEP-ekben.

Ezenkívül az NGS-t az elsődleges daganatokból és áttétekből származó DNS-en is elvégzik, hogy igazolják a DNS-mutációkat, különösen az ER-ben és más ismert onkogénekben, beleértve a WP3-ban vizsgáltakat is. A DNS-szekvenálást az Oncomine Comprehensive Assay segítségével végezzük. Ez egy amplikon alapú megközelítés, amely a hotspot SNV-ket, indeleket és CNV-ket elemzi. Ezek az elemzések biológiai megértést és háttérismeretet nyújtanak számunkra az egyes daganatok esetében, és ezek az adatsorok összevethetők a nemrég publikált adatokkal.

WP 2. Keringő tumorsejtek (CTC).

Keringő daganatsejtek (Onkológiai csoport) A keringő daganatsejteket perifériás vérmintákból sűrűség-centrifugálással, majd a leukociták immunmágneses kimerítésével gazdagítják. Az onkológiai csoport a közelmúltban kifejlesztett és közzétett egy új kimerítési módszert, a MINDEC-et (Multi-marker Immunomagnetic Negative Depletion Enrichment of CTCs), amely kiváló gyógyulási és dúsulási rátákkal rendelkezik. Az RNS-t és a DNS-t egyidejűleg izolálják a dúsított frakcióból, hogy lehetővé tegyék a CTC kimutatását mind RNS, mind DNS-alapú megközelítéssel. A specifikus mRNS-markereket, amelyek magas szintje van a tumorsejtekben és alacsony a normál leukocitákban, előzetesen amplifikálják és valós idejű PCR-rel kvantifikálják, mint a CTC-k helyettesítő markereit. Mind a hámspecifikus markerek, mind az epiteliális mezenchimális átmenettel kapcsolatos markerek a marker panel részét képezik. Eddig a kutatók 170 egymást követő vérmintát elemeztek a nagyobb PBCB kohorszból, amelyeket a MINDEC eljárással gazdagítottak, és a minták körülbelül 20%-ában találtak bizonyítékot a CTC-kre (mind az alacsony, mind a magas kockázatú betegektől), ami bátorít bennünket. folytatni ezt a projektet. A kutatók összehasonlítás céljából 30 egészséges női önkéntes vérmintáját is elemezték. A 125 magas kockázatú betegtől származó összes vérmintát elemzik (körülbelül 575 mintát). A CTC-k jelenlétét vagy szintjét a vizsgált mintákban később összehasonlítják az ismert prognosztikai tényezőkkel, a kezelés hatásával és a betegség kimenetelével.

WP 3. keringő tumor DNS (ctDNS).

A tumorspecifikus mutációk felhasználhatók a ctDNS markereiként, mivel nincsenek jelen a normál sejtekben és a normál plazma DNS-ben. Az onkológiai csoport a közelmúltban kimutatta a ctDNS mérések klinikai jelentőségét hasnyálmirigyrákban. A kutatók most célzott, következő generációs szekvenálás segítségével mérik a ctDNS-szinteket magas kockázatú emlőrákos betegek plazmamintáiban. A közelmúltban megjelent "Oncomine emlő cfDNS vizsgálata" (Thermo Fisher) egy tíz olyan génből álló panel mutációinak kimutatására szolgál majd, amelyek mellrákban gyakran mutációt mutatnak. Az assay a templátok molekuláris vonalkódolásán alapul, és lehetővé teszi a mutációk reprodukálható kimutatását egészen a kontrollminták 0,1%-áig. Figyelembe véve a sejtmentes DNS (=cfDNS) alacsony koncentrációját a plazmában (tipikusan 10 ng/ml vér), a 0,1%-os érzékenység elegendőnek tekinthető. A szekvenálást az Ion Proton NGS műszerünkön (Life Technologies) végezzük. Ebben a munkacsoportban a 125 magas kockázatú beteg preoperatív vérmintáját és éves követési mintáit elemzik. 30 egészséges női önkéntes vérmintáját már gyűjtötték, és összehasonlítás céljából elemezni fogják.

A daganat-specifikus mutációk jelenlétét és szintjét a kezelés hatásával és a betegség kimenetelével összefüggésben elemzik. A primer tumorbiopsziában és a plazmamintában lévő mutációs profilt összehasonlítjuk a lehetséges heterogenitás feltárása érdekében. Ezenkívül a ctDNS mutációs profiljának longitudinális változásait összehasonlítják a betegség kialakulásával, hogy esetleg fény derüljön a kezelésrezisztenciát vagy a betegség késői visszaesését okozó biológiai mechanizmusokra.

WP 4. mikroRNS (miRNS)

Keringő mikroRNS exoszómákból és TEP-ekből (Pathology group) A teljes RNS-t az exoszómákból és a TEP-eket izoláljuk a kezelés előtt és alatt vett vérmintákból. A kutatók a közelmúltban módszereket dolgoztak ki a teljes RNS exoszómákból történő izolálására (exoRNeasy serum Plasma kit (Qiagen) és miRCURY RNS izolációs készlet (Exiqon) és TEP-k segítségével. Az említett protokollt alkalmazva az exoszómák teljes RNS-ét már izolálták mind a 125 nagy kockázatú betegből, akik először jártak/kezelés előtt, ezenkívül az ezektől a betegektől vett utolsó vérmintákból teljes RNS izolálásra kerül mind az exoszómákból, mind a TEP-ekből. Ezenkívül az izolált RNS-en mikroRNS-profilt készítenek az Ion Proton műszerünkhöz már kialakított csővezeték és platform segítségével. Ezeket a profilokat összehasonlítjuk az elsődleges tumorból (WP1) származó mRNS-miRNS profilok bioinformatikai elemzésével és a kezelés előtt vett mintákkal. A kezelés előtt a szövetmintában és/vagy a vérmintában nem található mikroRNS-ek, de közvetlenül a kiújulás megjelenése előtt megjelennek a vérben, visszamenőleg nyomon követhetők a korábbi vérmintákban, hogy megtudjuk, mennyire érzékenyek ezek a mikroRNS-ek a kezelés előrejelzésében. ellenállás. A TEP-ekből származó mikroRNS-profilt összehasonlítják az exoszómákból származó mikroRNS-profilokkal és az elsődleges daganat mRNS-miRNS-profiljaival (WP1, hogy kiderüljön, a TEP-ek tükrözik-e a daganatot, és megvan-e a lehetőség a visszaesés előrejelzésére).

WP 5. Anyagcsere

A metabolomika a sejtmetabolizmus szubsztrátjait, köztitermékeit és végtermékeit, például aminosavakat, cukrokat és kis szerves savakat tartalmazó kis molekulák tanulmányozása. A rákos sejtek metabolikus állapota lényegesen megváltozik a normál sejtekhez képest, ami diagnosztikai célokra hasznosítható. A daganatszövetből származó specifikus metabolikus aláírások további információkat nyújtanak az emlőrák altípusainak meghatározásához és a kimenetel előrejelzéséhez1. Például az ösztrogénreceptor (ER) pozitív rákban szenvedő betegek rossz prognózisa a megnövekedett tumorlaktát- és glicinszinthez kapcsolódik. A primer daganatok metabolikus elemzése szintén prediktív értéket mutatott a lokálisan előrehaladott betegségben szenvedő betegek neoadjuváns kezelésében.

A keringő metabolitokról kimutatták, hogy prognosztikai információt szolgáltatnak operálható emlőrák esetén, és tovább rétegzik a kockázatot a meglévő genetikailag meghatározott kockázati kategóriákon belül. Fontos, hogy a metabolomikus változások közvetlenül vagy közvetve származhatnak mikrometasztatikus betegségből, nem pedig elsődleges daganatból. A közelmúltban a kutatók kimutatták, hogy a szisztémás laktát- és piruvátszintek gyengébb kimenetelre utalnak az operálható ER-pozitív emlőrákban szenvedő betegeknél. A daganattal szomszédos szövetek és az immunológiai válaszok szintén hozzájárulhatnak a megváltozott metabolomikus profilhoz. Bizonyíték van arra is, hogy a metabolikus profilalkotás felhasználható a betegek megfigyelésére egyes rákos megbetegedések esetén, bár az ilyen bizonyítékok még mindig hiányoznak az emlőrák esetében. Ezért a kutatók azt kívánják megvizsgálni, hogy a posztoperatív monitorozás a vérben végzett metabolikus profilok segítségével hasznos-e az emlőrák kiújulásának korai felismerésében.

WP 6. Integratív molekuláris monitorozás a recidíva kimutatására

Az új technológia forradalmasította a klinikai mintákból nyerhető biológiai információk szintjét, amelyet az új "omika" kifejezések jelentenek: genomics, transscriptomics, metabolomics stb. Az ilyen nagy adatkészletek elérhetősége még a nyilvánosság számára is ösztönözte olyan integratív módszerek kifejlesztését, amelyek létfontosságú információkat tudnak kinyerni több kombinált adatforrásból. Meglepő új kapcsolatokat tártak fel az omics-adatkészletek között az ilyen megközelítések, amelyekre példa a sejtmentes DNS-fragmentáció és a génexpresszió közötti kapcsolat46. Ennek megfelelően az emlőrákról szerzett ismereteinket integráló megközelítésekkel is bővítették, ami a betegség átfogóbb megértését eredményezte. Az emlőrák prognosztikai alosztályozását például finomították, és új tumorspecifikus antigéneket azonosítottak. Az integrált molekuláris adatokról még azt is kimutatták, hogy nagyobb prognosztikai erejük van, mint a különálló molekuláris szintek emlőrák esetén. Ezért a jelenlegi projektben a perifériás vérminták genetikai (ctDNS), transzkriptomikus (miRNS) és metabolomikus adatszintjeinek kombinált elemzését tervezik, hogy maximalizálják a közös biomarker potenciáljukat operálható emlőrákban.

Mintaméret számítások.

A kutatók az SPSS Sample Power szoftverrel mintaméret-számításokat végeztek. Ezek a számítások azt mutatták, hogy 125 magas kockázatú betegnek elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy 80%-os log rank tesztteljesítményt adjon a ctDNS/CTC kimutatás prognosztikai értékének műtét előtti tesztelésekor. A mintanagyság számítása azon a minősített feltételezésen alapult, hogy az átlagos 5 éves túlélési arány a magas kockázatú csoportban 90%, míg a ctDNA/CTC pozitív és negatív alcsoportokban 75%, illetve 95%. A becsült 125 beteg közül 30 ctDNS/CTC pozitív, 95 pedig negatív volt.

-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----

B. A tamoxifen gyógyszeres monitorozásának javítása emlőrák esetén

Az összes emlőrák körülbelül 75%-a a luminális altípusokhoz tartozik, amelyek az ösztrogénreceptor és a progeszteron receptor hormonális receptorokat fejezik ki. Ezeket a betegeket antiösztrogén gyógyszerekkel kezelik; tamoxifen és/vagy aromatáz inhibitorok. A két legaktívabb tamoxifen metabolit a Z-4OHtam és a Z-4OHNDtam (Z-endoxifen) 30-100-szor nagyobb affinitással rendelkezik az ER iránt, mint a tamoxifen. Ezek a metabolitok végső soron a mikrometasztatikus betegség felszámolását célzó ER-szinten a blokkoló hatást jelentik, és felelősek a jobb túlélésért ezen adjuváns szisztémás kezelés bevezetését követően. Ezeknek a metabolitoknak a közvetlen mérése megkerül minden olyan zavart, amely a CYP2D6 aktivitás sokféleségéből ered, azaz az alternatív metabolikus utak, a gyógyszerhez való tapadás és a gyógyszerkölcsönhatások gátlása. Új LC / MS-MS módszerünk figyelembe veszi az összes fent említett változót, és funkcionális leolvasási jelentést ad az aktív tamoxifen metabolitok szérumszintjéről az egyes betegekben. Ezzel a módszerrel megkülönböztethető az Endoxifen és a 4-OHtam inaktív és aktív izomerje is, amelyek a tamoxifen legaktívabb ER-blokkoló metabolitjai. Az Oslo Breast Cancer Research Grouppal együttműködve a kutatók a közelmúltban egy retrospektív megfigyeléses vizsgálatban kimutatták, hogy az alacsony Z-4OHtam < 3,26 nM vagy Z-Endoxifen < 9,00 nM (az összes beteg körülbelül 12%-a) szérumkoncentrációja szignifikáns. rosszabb emlőrák-specifikus és teljes túlélés, mint azoknál a betegeknél, akiknél a szérumkoncentráció meghaladja ezeket a küszöbértékeket (korrigált HR = 4,3; CI95 = 1,9-13,6) (piros görbék a 4. ábrán). Azoknál a betegeknél, akiknél nagyon magas ezeknek a metabolitoknak a szintje (a betegek körülbelül 12%-a) nem volt emlőspecifikus végpont. Most a kutatóknak független beteganyagban kell validálniuk ezt a felfedezést. Ha validálják, ez közvetlen klinikai előnyökkel jár az ER + emlőrákos betegek 25%-ánál, akik adjuváns tamoxifen kezelést terveznek. Az ilyen terápiás gyógyszermonitoring (TDM) azonosíthatja azokat a kockázatos betegeket, akiknél az aktív tamoxifen metabolitok szintje nem megfelelő. Ez ezeknél a betegeknél dózisemeléshez vagy alternatív endokrin kezelési formára való átálláshoz vezethet. A nagyon magas metabolitszintű betegek folytathatják a tamoxifen szedését, és nem kell aromatázgátlóra váltaniuk.

Így a TDM paradigmatikus váltásnak bizonyulhat az ER-pozitív emlőrák endokrin tam kezelésében. Fontos, hogy ebben a vizsgálatban nagyon rövid a távolság a „padtól az ágyig” a közelmúltbeli eredményeinknek, egy megvalósítható módszernek és a tamoxifen klinikai környezetben szerzett több mint 30 éves tapasztalatának köszönhetően.

-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----

C. Tumor mikrokörnyezet emlőrákban – zsíros stromális immuninfiltráció és interakció a tumorral a növekedési zónában

Háttér: A mellrák még mindig a leggyakoribb ráktípus a nők körében a nyugati világban, beleértve Norvégiát is. Évente körülbelül 3500 új norvég emlőrákos beteget diagnosztizálnak. Az elmúlt 50 év során Norvégiában több mint kétszeresére nőtt a mellrák előfordulása. Érdekes módon ugyanebben az időszakban a túlsúly és az elhízás riasztóan megnőtt. Az emlőrákdaganatok molekuláris altípusa javította belső biológiájának megértését. Ez személyre szabottabb kezelési megközelítést tett lehetővé, és az elmúlt 20 évben javította a mellrákos betegek kimenetelét.

Az emlőrák diagnosztikája manapság a molekuláris altípuson túl stádiumbesorolásból (TNM-osztályozási rendszeren keresztül) és patológus által végzett mikroszkópos vizsgálatból áll. Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre a tumor mikrokörnyezet értékelésének prognosztikai értékére (pl. tumor infiltráló limfociták (TIL)) az emlőrák diagnosztikájának részeként, de a klinikai gyakorlatban ez még nem valósult meg. A TIL-ek nagy száma erősen összefügg a jó prognózissal hármas negatív emlőrákban szenvedő betegeknél, de nem mutattak ki ilyen összefüggést a luminalis emlőrákban. Az emlő zsírszövetében lévő makrofágok két különböző fenotípusra különböznek, amelyeket gyakran M1 és M2 kategóriába sorolnak, az utóbbiak növekedése mellrák esetén. Az M1 megtámadja és fagocitálja a rákos sejteket, míg az M2 gyulladáscsökkentő tulajdonságokkal rendelkezik, és kimutatták, hogy daganatot elősegítő funkciója van.

A jelen projekt bővíti ismereteinket az elsődleges emlődaganat és a juxta-tumorális zsírszövet immunsejt-infiltrációja közötti kölcsönhatásról. Eredményeink összefüggést mutatnak majd a molekuláris emlőrák altípusaival, a daganat közelségével, a proliferáció markereivel és végső soron a klinikai kimenetelekkel. A kutatók úgy vélik, hogy ez a tudás új prediktív célpontokat jelent majd az immunmoduláló adjuváns rákterápia számára. Ez a PhD projekt három egymással összefüggő munkacsomagot (WP) tartalmaz, amelyek végső célja a gyulladás markereinek azonosítása a juxta-tumorális zsírszövetben, amelyek relevánsak az emlőrák adjuváns terápiájának klinikai értékelésében. A WP 1-ben és 2-ben a juxta-tumorális zsírszövet fenotípusos és genomiális tájképét jellemezzük, a WP 3-ban pedig azt vizsgálják a kutatások, hogy ezek az ismeretek előre jelezhetik-e a klinikai kimenetelt.

A projekt a Haukeland Egyetemi Kórház (HUH) és a Stavangeri Egyetemi Kórház (SUH) közötti erős regionális együttműködésen alapul. A jelenlegi projekthez a kutatások szisztematikusan gyűjtöttek zsír- és daganatszövetet az SUH-n 30 egymást követő emlőrákos betegtől, akiknek mastectomiája volt. A műtéti emlőmintákat haladéktalanul továbbítják a patológushoz, aki morfológiai ellenőrzés mellett mintát vesz a primer daganat invazív frontjából és magjából (0,5x1x1 cm) a megfelelő szövetből. A távoli ellenoldali kvadránsból származó normál emlőszövetből származó kontrollokat (2000 mg) szintén összegyűjti és morfológiailag ellenőrzi a patológus. A szövetet párhuzamos párokban gyűjtjük össze. Az egyik mintát azonnal lefagyasztják folyékony nitrogénben tartósítás céljából, míg az egyes párok másik felét formalinban tartósítják és paraffinban (FFPE) rögzítik. Ezenkívül három pár zsírszövet-minta (egyenként 1x1x1 cm-es) a tumor határától növekvő távolsággal a tumor terület invazív frontjából származó zsírszövet gradienst alkot. Az összegyűjtött gradienseket azonnal lefagyasztják folyékony nitrogénben, és mindegyik pár felét FFPE-ként tárolják. A kutatások egy kísérleti vizsgálatot végeztek, amely megerősítette a fagyasztott szövetmintákból az RNS-szekvenáláshoz elegendő RNS-termelést.

A szövetet az általános kutatási biobank, a Prospective Breast Cancer Biobank (PBCB) (REK# 2010/1957), folyamatban lévő biobank-projekt részeként gyűjtik össze.

A retrospektív stavangeri kohorsz minden olyan emlőrákos betegből áll, akiknél először invazív emlőrákot diagnosztizáltak a Stavangeri Egyetemi Kórház Patológiai osztályán 1993 és 2004 között. Mivel a SUH az egyetlen kórház a régióban, ez egy valódi populáció alapú biobank, amely már tartalmazza a klinikopatológiai adatokat, mint például: osztályozás, stádium, TNM, kezelési és proliferációs markerek (Ki-67, PPH3/MAI); az utolsó klinikai ellenőrzésre 2016-ban került sor.

A kutatások négy fő hipotézist tartalmaznak a mellrák gyulladásával és immunsejt-infiltrációjával kapcsolatban:

1. A tumor határához közeli juxta-tumorális zsírszövet fokozott gyulladást és immunsejt-infiltrációt mutat.
2. A gyulladás és az immunsejt-infiltráció a tumor határától való nagyobb távolsággal gyengül.
3. Az emlőrák különböző altípusai között (Luminal A, Luminal B és Basal hasonló) különbségek vannak a gyulladásban és az immunsejtek beszűrődésében.
4. A fokozott gyulladás és az immunsejtek infiltrációja összefüggésben áll a kedvezőtlen klinikai eredménnyel (pl. betegség visszaesése).

4.1 A VIZSGÁLAT TERVEZÉSE, MÓDSZEREI ÉS ELEMZÉSEI

A kutatások négy fő hipotézist tartalmaznak a mellrák gyulladásával és immunsejt-infiltrációjával kapcsolatban:

1. A tumor határához közeli juxta-tumorális zsírszövet fokozott gyulladást és immunsejt-infiltrációt mutat.
2. A gyulladás és az immunsejt-infiltráció a tumor határától való nagyobb távolsággal gyengül.
3. Az emlőrák különböző altípusai között (Luminal A, Luminal B és Basal hasonló) különbségek vannak a gyulladásban és az immunsejtek beszűrődésében.
4. A fokozott gyulladás és az immunsejtek infiltrációja összefüggésben áll a kedvezőtlen klinikai eredménnyel (pl. betegség visszaesése).

WP 1: IMMUNUSEJTBEILLEGÉSÉNEK MORPHOLÓGIAI ÉS GENOMIKAI KÉPEZÉSE A MELLRÁK KÖRNYEZETT ZSÍVSZÖVETBEN

Háttér: A gyulladás fontos elősegítője a daganatok kialakulásának (16). Kimutatták, hogy a mellrák közelében lévő zsírszövet fokozott immunsejt-infiltrációt mutat, de még nem ismert, hogy ez hogyan kapcsolódik a molekuláris altípusokhoz és/vagy a daganat közelségéhez. A kutatások során IHC és RNS szekvenálást alkalmaznak az emlőrákot körülvevő zsírszövetben a gyulladás mértékének, az immunsejtek infiltrációjának és az immungénexpressziós aláírások értékelésére.

Tervezés: Prospektív exploratív vizsgálat Betegek, anyag- és teljesítményszámítás: A prospektíven gyűjtött mastectomiás mintákból zsírszövetet gyűjtünk. A szövetmintákat három különböző molekuláris alcsoportból (Luminal A, Luminal B és Basal like mellrák) gyűjtik, mindegyik csoportban 10-et. A magbiopsziákat egy gradiensben gyűjtjük, a tumor határától növekvő távolsággal (3. 1). A Norwegian Genomics Consortium (NGC) megerősítette, hogy az egyes emlőrák-altípusok szelekcióján alapuló mintaméretek elegendőek a statisztikai teljesítményhez.

Módszerek: A tumorból, invazív front- és zsírszövetből (1. ábra) származó formalinnal fixált szövet tárgylemezeit IHC-vel és immunsejtek elleni antitestekkel (teljes immunsejtek, CD45; T-sejtek, CD3, CD8, FoxP3; mieloid sejtek, CD68) megfestik. , HLA-DR). A tárgylemezeket mikroszkóppal értékeljük, és az eredményeket korreláljuk az emlőrák molekuláris alcsoportjaival, a lokalizációval a tumorral és a proliferációs markerekkel (pl. Ki67, PPH3 és MAI). Ezzel párhuzamosan a kutatások RNS-szekvenálást végeznek a fent leírtakkal azonos szövetmintákból gyűjtött fagyasztott szöveteken. Az RNAseq-adatokon többféle elemzési megközelítést alkalmaznak. Kivéve az adatok feltáró, specifikus elemzési algoritmusainak elemzését, beleértve többek között a dekonvoluciós immunsejteket (ABIS, CIBERSORTx) és pontosabban a tumor immunszignációit (TIP elemzés).

Várt eredmény: A kutatások arra számítanak, hogy fokozott gyulladást és immunsejt-infiltrációt találnak a juxta-tumorális zsírszövetben, valamint a gyulladásos génalakzatok megváltozott expresszióját, amit a kutatások tovább vizsgálhatnak a WP 2-ben.

WP 2: GYULLADÁSOS REAKCIÓ ÉRTÉKELÉSE A JUXTA-TUMOURÁLIS ZSÍRSZÖVETBEN MELLRÁKBAN IMMUNOHISZTOKÉMIAI ÉS KÉPVISELŐ TÖMEGCITOMETRIA ALKALMAZÁSÁVAL.

Háttér: Az emlőráksejtek kölcsönhatásba lépnek a környező szövetekkel, és gyulladást és immunsejtek beszűrődését okozzák a daganatban és a zsírszövetben. A képalkotó tömegcitometria kimutatta, hogy az immunsejt-infiltráció a daganatokban korrelál a prognózissal, de egyelőre nem készültek olyan vizsgálatok, amelyek azt vizsgálták volna, hogy a daganatot körülvevő zsírszövet is mutat-e immunsejt-infiltráció szerkezeti mintázatát. Ezért a kutatások az emlőrákdaganatokat körülvevő zsírszövetet vizsgálják a Hyperion™ Imaging Mass Cytometry segítségével.

Tervezés: Prospektív exploratív vizsgálat Betegek, anyag- és teljesítményszámítás: A szövetmintákat 30 prospektíven nyert mastectomiás mintából gyűjtjük, három különböző molekuláris alcsoporttal (Luminal A, Luminal B és Basal like mellrák), mindegyik csoportban 10-10. A zsírszövetet egy gradiensben gyűjtjük a tumortól és az ellenoldali kvadránstól kontrollmintaként (1. ábra). 2). A 30 betegből álló minta elegendőnek tekinthető egy ilyen jellegű feltáró vizsgálathoz.

Módszerek: Egy akár 50 egyedi antitestből álló Hyperion™ IMC panelt fejlesztenek ki az UoB központi létesítményében már meglévő és validált panel alapján, amelyet a kutatások korábban más projektekben is sikeresen felhasználtak. A rendelkezésre álló panelt tovább bővítik az 1. munkacsoport megállapításai alapján, és először „nem alapvető” emlőszövetmintákon validálják, mielőtt a fent leírt vizsgálati mintákon felhasználnák. A Hyperion™ IMC segítségével a kutatások a gyulladásos reakciók szintjét kívánják elemezni a juxta-tumorális zsírszövetben. Az IMC-adatokat histoCAT+, MAV és FlowJo segítségével elemzik (jellemzően áramlási citometriai adatok elemzésére használják, de kiválóan alkalmas nagy paraméterű képalkotó elemzésekre is). Továbbá a kutatások képesek lesznek felhasználni a WP 1-ben azonosított, ismert és új faktorok génexpressziós adatait, és megjeleníteni, hogy az expresszió generalizált vagy kompartmentalizált-e a zsírszövetben. Kontrollként az ellenoldali kvadránsból származó normál zsíros mellszövetet használjuk. A különböző molekuláris altípusok juxta-tumorális zsírszövetének gyulladására kifejtett BC hatásának részletesebb vizsgálata érdekében a kutatások célja három, a daganatból kinyúló szövetszegmens szövetének megfestése is, annak megállapítása érdekében, hogy a szint függ-e a távolság a daganattól vagy a molekuláris altípustól (1. ábra). A juxta-tumorális zsírszövet gyulladását morfológiailag is értékeljük IHC segítségével. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy kiválasszuk az érdeklődésre számot tartó régiókat az IMC segítségével.

Várt eredmény: A kutatások várhatóan fokozott gyulladást és immunsejt-infiltrációt találnak a daganat közelében lévő zsírszövetben, és új biomarkereket azonosítanak a zsírszövetben, amelyek lehetővé teszik a WP 3 klinikai jelentőségének vizsgálatát.

WP 3: GYULLADÁSOS REAKCIÓ JUXTA-TUMOURAL ZSÍRSZÖVETBEN MELLRÁKBAN ÉS KLINIKAI EREDMÉNY.

Háttér:

Az immunhisztokémia az emlőrák diagnosztikájának sarokköve, és a fő módszerként szolgál az emlőrák molekuláris alcsoportjainak és a proliferációs markerek, például a Ki-67 azonosítására. Ez elengedhetetlen annak meghatározásához, hogy az adott beteg számára melyik kezelési mód a legmegfelelőbb. A daganatszövet heterogenitása (mind a tumorsejtekben, mind a beszűrődő immunsejtekben) összefüggésbe hozható a klinikai eredmények különbségével, de még nem ismert, hogy ugyanez vonatkozik-e a daganatot körülvevő zsírszövetre is. Így a kutatások a juxta-tumorális zsírszövetet gyulladásra és immunsejt-infiltrációra vizsgálják, és ezt korrelálják a mellrákos betegek klinikai kimenetelével.

Tervezés: Klinikai megfigyeléses vizsgálat

Betegek és módszerek: Számos 3500 emlőrákos beteg halmozódik fel egy biobankban, átlagosan 15 éves követési idővel. Az ezekből a betegekből származó szövetminták nagy választékát értékelik a zsírszövetben lévő immunsejtek és a WP 1-ben és 2-ben IHC segítségével felfedezett biomarkerek tekintetében. A mintákat három csoportba osztjuk molekuláris alcsoportok szerint (pl. Luminal A, Luminal B és Basal, mint a mellrák). A szövetlemezeket elemzik, és az eredményeket korrelálják a betegnaplók klinikai eredményeivel (a folyóiratokhoz való hozzáférést a REK már jóváhagyta). A Cox arányos kockázati arány és log-rank teszt segítségével a kutatások értékelik a zsírszövetben megnövekedett gyulladás hatását a betegek túlélésére.

Teljesítményszámítás: A kutatások megbecsülték a recidívamentes túlélés különbségének teszterejét a juxta tumoros gyulladásra pozitív és negatív betegek között, IHC és IMC alapján. A hatás mértéke a Cox-regressziós módszerrel kiszámított veszélyarány (HR). Például: 1000, 15%-os kiújulási arányú beteg legalább 150 végpontot hozott létre. Ha a gyulladás aránya 20%, akkor a kutatások 80%-os képességgel rendelkeznek a túlélési különbség kimutatására 1,80 vagy annál nagyobb kockázati arány mellett.

Várható eredmény: Ez az utolsó munkacsomag annak az elvnek a bizonyítására szolgál, hogy lehetséges a juxta-tumorális zsírszövet szövettani vizsgálatának beépítése az emlőrák diagnosztikájába. Hosszabb távon a kutatások célja a zsírszövetben az immuninfiltráció új specifikus biomarkereinek azonosítása, amelyek összefüggést mutatnak az emlőrákos betegek káros kimenetelével. Az ilyen biomarkerek prediktív eszközként szolgálhatnak az adjuváns gyulladásgátló vagy immunmoduláló kezelésre alkalmas betegek azonosítására.

-------------------------------------------------- -----------------------------------------------

D. Figyelje a mellékhatásokat, az életminőséget, a depressziót, a fáradtságot és a munkában való részvételt Háttér

Az emlőrák kezelése során minden műtétet, kemoterápiát, sugárterápiát és különféle célzott terápiás lehetőségeket alkalmaznak, mint például az antiösztrogén és az anti-HER-2 terápia. Ezek a kezelési lehetőségek zavaró mellékhatásokat okoznak mind rövid, mind hosszú távon. Fontos, hogy a közelmúltban bonyolultabb összefüggéseket fedeztek fel az onkológiai terápiás módok és az emlőrákos betegek szubjektív egészségügyi panaszai között. A fáradtság, a szorongás és a depresszió pontszámai valószínűleg a teljes kezelési teher funkcionális kijelzései. A rákellenes kezelés jelentős hatással van a rákot túlélők életminőségére és társadalmi vonatkozásaira is, amely kiterjed a munkában való részvételre is. A betegszabadság (SL) a mellrák diagnosztizálása után öt évvel jobban függ a társadalmi tényezőktől, mint a betegségtől (2). Ezért a mellrák kétszer sújtja a nőket; először a betegségteher, majd a társadalmi-gazdasági gondok. Egy retrospektív regiszter alapú vizsgálat szerint a mellrák túlélőinek közel háromszor nagyobb a rokkantsági nyugdíjban (DP) való részesülésének kockázata, mint a rákmentes betegeknél (3). Ez a vizsgálat azonban többnyire elhagyott onkológiai kezelési rendeken alapult.

Célok

A tanulmány célja a hosszú távú SL-, WAA- vagy DP-vevővé válás kockázati tényezőinek azonosítása mélyreható kvalitatív elemzéssel és vegyes módszerrel a PROM adatok, a klinikai/biológiai adatok és a NAV-adatok háromszögelésével. A NAV-adatok végpontként való felhasználása értékes információkkal szolgál a klinikusok és háziorvosok számára, akik optimalizálhatják a nyomon követést a munkában való részvétel tekintetében is. Ennélfogva a kutatók robusztus vizsgálati tervvel rendelkeznek a magas SL-, WAA- és DP-arányok fisk-tényezőinek azonosítására. Végső soron a nyomozók célja, hogy csökkentsék a mellrák által a társadalom számára okozott pénzügyi kiadásokat.

Tanulmánytervezés / anyagok és módszerek.

A vizsgálati terv egy megfigyeléses vizsgálat, amelyben a kutatók a jelen tanulmányban feltérképezik a magas SL, WAA és DP előfordulási arányát és a fogak fisk tényezőit az emlőrák túlélői körében a naprakész kezelési ütemterv szerint. A nyomozók 4 lépéses transzlációs megközelítést fognak követni:

1. A kutatók először egy feltáró kvalitatív tanulmányt fognak végezni az egészség- és munkapolitika norvég kontextusban történő dokumentumelemzésével, a félig strukturált interjúk empirikus adataival kombinálva, valamint 20 magas kockázatú beteget bevonó fókuszcsoportból) tematikus elemzés céljából. Ennek a kvalitatív projektnek az elméleti kerete a szimbolikus interakcionizmusból származik, amelyben a jelentés feltárása és megértése meghatározott összefüggésekben a cél. Mivel az értelmes társadalmi és szakmai interakciók fontosak az emlőrákos betegek pszichoszociális rehabilitációjában, a szimbolikus interakcionizmus megfelelő módszertani keret. Ez a kvalitatív megközelítés fogja megteremteni a megközelítés alapjait az alábbi PROM alapú és NAV-adatbázis orientált tanulmányokban.

2. NAV- adatok

   A nyomozók jelenleg Anneline Christine Teigen igazgatóhelyettessel és Günter Olsborg vezető tanácsadóval dolgoznak együtt a NAV-Rogalandban és a Norvég Statisztikai Hivatal (SSB) Mikrodata részlegével. Ennek az együttműködésnek az a célja, hogy a NAV-Rogaland szakértőivel közösen minél több ismeretet szerezzenek a társadalombiztosítási szolgáltatások igénybevételéről az emlőrákos betegek körében, valamint az SSB-vel közösen az FD-trygd adatbázis segítségével megbízható prospektív szociodemográfiai adatokat szerezzenek az SL-ekről (rövid és hosszú). időtartam), munkaértékelési juttatás (WAA) (Arbeidsavklaringspenger) és DP-k (mindkettő időkorlátozott

   és élethosszig)

3. A betegek által jelentett kimeneti mérési adatok (PROM) a kiinduláskor, majd ezt követően évente minden PerMoBreCan betegtől származnak. A PROM adatok a következőkből állnak: 1.HRQoL műszerek (EORTC QLQ-C30,EORTC QLQ-BR23 és FACT B), 2.Kórházi Szorongás és Depresszió Skála, HAD, 3. Fáradtságmérő műszerek Fatique Impact Scale, FIS; Fáradtság súlyossági skála (FSS) és VAS-fáradtság, 4. Mellékhatások kérdőívei, 5. Ízületi fájdalom kérdőív, 6. The Mishel Uncertainty in Illness Scale, MUIS; és 7. Táplálkozási szokások kérdőív és a 8.ROMA III bélpanaszok (IBD és IBS) kérdőív.
4. Biomarker azonosítás.

A vizsgálatban részt vevő összes beteget a keringő, fáradtsághoz kapcsolódó biomarkereken szűrik. Ezek a biomarkerek fehérjeszinten, genetikai expressziós szinten és epigenetikai szinten is megtalálhatók. Régóta kialakult kellemes együttműködésünk prof. Roald Omdal, a Stavangeri Egyetemi Kórház klinikai immunológusa és a transzalcionális fáradtság kutatója, elkötelezte magát, hogy kutatólaboratóriumában elvégzi ezeket az elemzéseket.