Prospettiva biobanca del cancro al seno (PBCB)

A. Diagnosi precoce delle recidive sistemiche nel carcinoma mammario.

WP 1. Analisi del tumore primitivo.

Analisi del tumore primitivo e delle metastasi (gruppo Patologia). In questo work package sia il DNA che l'RNA dei tumori primari di 125 pazienti ad alto rischio (Luminal-B) saranno analizzati mediante sequenziamento di nuova generazione (NGS). Inoltre, gli investigatori analizzeranno anche il DNA e l'RNA dalle lesioni metastatiche disponibili (attualmente materiale disponibile per 3/8) che sono apparse e appariranno durante il periodo di studio.

MiRNA e mRNA saranno profilati utilizzando PureLink ™ miRNA Isolation Kit (Invitrogen), Dynabeads mRNA direct micro kit (Ambion) e Ion total RNA-seq kit V2 (Life Technologies) sul nostro strumento Ion Proton NGS. Le analisi bioinformatiche dei profili di espressione accoppiati di mRNA e microRNA saranno utilizzate per rivelare microRNA espressi in modo differenziato tra pazienti con e senza recidive in trattamento. Questi dati saranno collegati ai nostri studi precedenti e utilizzati per identificare i candidati target per l'analisi del microRNA negli esosomi e nei TEP.

Inoltre, l'NGS sarà eseguito anche sul DNA dei tumori primari e delle metastasi per verificare le mutazioni del DNA soprattutto in ER e altri oncogeni noti, compresi quelli esaminati nel WP3. Il sequenziamento del DNA verrà eseguito utilizzando l'Oncomine Comprehensive Assay. Si tratta di un approccio basato sull'amplicone che analizza SNV, indel e CNV hotspot. Queste analisi ci forniranno una comprensione biologica e una conoscenza di base per ciascuno dei singoli tumori e questi set di dati possono anche essere confrontati con i dati pubblicati di recente.

WP 2. Cellule tumorali circolanti (CTC).

Cellule tumorali circolanti (gruppo Oncologia) Le cellule tumorali circolanti vengono arricchite da campioni di sangue periferico mediante centrifugazione della densità e successiva deplezione immunomagnetica dei leucociti. Il gruppo di oncologia ha recentemente sviluppato e pubblicato un nuovo metodo di deplezione, denominato MINDEC (Multi-marker Immuno- magnetic Negative Depletion Enrichment of CTCs), che ha tassi di recupero e arricchimento superiori. L'RNA e il DNA vengono isolati simultaneamente dalla frazione arricchita, per consentire il rilevamento di CTC mediante approcci basati sia sull'RNA che sul DNA. Specifici marcatori di mRNA, con alti livelli nelle cellule tumorali e bassi livelli nei leucociti normali, vengono pre-amplificati e quantificati mediante PCR in tempo reale come marcatori surrogati per le CTC. Sia i marcatori specifici dell'epitelio che i marcatori relativi alla transizione mesenchimale epiteliale fanno parte del pannello dei marcatori. Fino ad ora, i ricercatori hanno analizzato 170 campioni di sangue consecutivi dalla più ampia coorte di PBCB, arricchiti dalla procedura MINDEC e hanno trovato prove di CTC in circa il 20% dei campioni (da pazienti sia a basso che ad alto rischio), una scoperta che ci incoraggia per continuare questo progetto. I ricercatori hanno anche analizzato i campioni di sangue di 30 volontarie sane per il confronto. Saranno analizzati tutti i campioni di sangue raccolti da 125 pazienti ad alto rischio (circa 575 campioni). La presenza o il livello di CTC nei campioni analizzati verrà successivamente confrontato con i fattori prognostici noti, l'effetto del trattamento e l'esito della malattia.

WP 3. DNA tumorale circolante (ctDNA).

Le mutazioni specifiche del tumore possono essere utilizzate come marcatori per il ctDNA perché non sono presenti nelle cellule normali e nel normale DNA plasmatico. Il gruppo di oncologia ha recentemente dimostrato la rilevanza clinica delle misurazioni del ctDNA nel carcinoma pancreatico. I ricercatori misureranno ora i livelli di ctDNA nei campioni di plasma di pazienti con carcinoma mammario ad alto rischio mediante sequenziamento mirato di nuova generazione. Il recentemente rilasciato "Oncomine breast cfDNA assay" (Thermo Fisher) verrà utilizzato per rilevare le mutazioni in un pannello di dieci geni che sono frequentemente mutati nel cancro al seno. Il test si basa sul codice a barre molecolare dei modelli e consente il rilevamento riproducibile delle mutazioni fino allo 0,1% dei campioni di controllo. Tenendo conto della bassa concentrazione di DNA libero cellulare (=cfDNA) nel plasma (tipicamente 10 ng per ml di sangue), una sensibilità dello 0,1% è considerata sufficiente. Il sequenziamento sarà eseguito sul nostro strumento Ion Proton NGS (Life Technologies). In questo WP verranno analizzati i campioni di sangue preoperatorio e di follow-up annuale dei 125 pazienti ad alto rischio. I campioni di sangue di 30 volontarie sane sono già stati raccolti e saranno analizzati per il confronto.

La presenza e il livello di mutazioni tumore-specifiche saranno analizzati in relazione all'effetto del trattamento e all'esito della malattia. Il profilo mutazionale nella biopsia del tumore primario e nei campioni di plasma sarà confrontato per rivelare la potenziale eterogeneità. Inoltre, i cambiamenti longitudinali nel profilo mutazionale del ctDNA saranno confrontati con lo sviluppo della malattia per far luce sui meccanismi biologici che causano resistenza al trattamento o recidive tardive della malattia.

WP 4. microRNA (miRNA)

MicroRNA circolante da esosomi e TEP (Pathology group) L'RNA totale sarà isolato da esosomi e TEP dai campioni di sangue prelevati prima e durante il trattamento. I ricercatori hanno recentemente stabilito metodi per l'isolamento dell'RNA totale dagli esosomi (utilizzando il kit exoRNeasy per il plasma del siero (Qiagen) e il kit di isolamento dell'RNA miRCURY (Exiqon)) e i TEP. Utilizzando il protocollo menzionato, l'RNA totale dagli esosomi è già stato isolato da tutti i 125 pazienti ad alto rischio prima visita/prima del trattamento, inoltre dagli ultimi campioni di sangue raccolti da questi pazienti, l'RNA totale sarà isolato sia dagli esosomi che dai TEP. Inoltre, il profilo del microRNA sarà eseguito sull'RNA isolato utilizzando la pipeline e la piattaforma già stabilite per il nostro strumento Ion Proton. Questi profili saranno confrontati con l'analisi bioinformatica dei profili mRNA-miRNA del tumore primario (WP1) ei campioni prelevati prima del trattamento. I microRNA che non sono presenti nel campione di tessuto e/o nel campione di sangue prima del trattamento, ma compaiono nel sangue subito prima che si manifesti una recidiva, possono quindi essere rintracciati retrospettivamente in precedenti campioni di sangue per vedere quanto sono sensibili questi microRNA nel predire il trattamento resistenza. Il profilo dei microRNA dei TEP sarà confrontato con il profilo dei microRNA degli esosomi e con i profili mRNA-miRNA del tumore primario (WP1, per vedere se i TEP riflettono il tumore e se hanno il potenziale per predire la recidiva.

WP 5. Metabolomica

La metabolomica è lo studio di piccole molecole comprendenti substrati, intermedi e prodotti finali del metabolismo cellulare, come amminoacidi, zuccheri e piccoli acidi organici. Lo stato metabolico delle cellule tumorali è sostanzialmente alterato rispetto alle cellule normali, un fatto che può essere utilizzato a fini diagnostici. Le firme metaboliche specifiche del tessuto tumorale forniscono informazioni aggiuntive per la determinazione dei sottotipi di cancro al seno e la previsione dell'esito1. Ad esempio, l'aumento dei livelli di lattato tumorale e glicina è correlato a una prognosi sfavorevole nei pazienti con cancro positivo al recettore degli estrogeni (ER). Le analisi metabolomiche dei tumori primari hanno anche dimostrato un valore predittivo in relazione al trattamento neoadiuvante di pazienti con malattia localmente avanzata.

È stato anche dimostrato che i metaboliti circolanti forniscono informazioni prognostiche nel carcinoma mammario operabile e stratificano ulteriormente il rischio all'interno delle categorie di rischio geneticamente determinate esistenti. È importante sottolineare che le alterazioni metabolomiche possono derivare direttamente o indirettamente dalla malattia micrometastatica, piuttosto che dal tumore primario. Recentemente, i ricercatori hanno dimostrato che i livelli sistemici di lattato e piruvato predicono un esito inferiore in pazienti con tumori al seno ER-positivi operabili. Anche il tessuto adiacente al tumore e le risposte immunologiche possono contribuire a un profilo metabolomico alterato. Esistono anche prove che il profilo metabolico può essere utilizzato per il monitoraggio dei pazienti in alcuni tipi di cancro, sebbene tali prove manchino ancora nel cancro al seno. Pertanto, i ricercatori intendono indagare se il monitoraggio postoperatorio mediante la profilazione metabolica nel sangue sia utile per la diagnosi precoce della recidiva del cancro al seno.

WP 6. Monitoraggio molecolare integrativo per il rilevamento delle recidive

La nuova tecnologia ha rivoluzionato il livello di informazioni biologiche ottenibili dai campioni clinici, rappresentate dai nuovi termini "omici" genomica, trascrittomica, metabolomica, ecc. La disponibilità di set di dati così grandi, anche di dominio pubblico, ha incoraggiato lo sviluppo di metodi integrativi in ​​grado di estrarre informazioni vitali da più fonti di dati combinate. Tali approcci hanno rivelato nuove sorprendenti connessioni tra set di dati omici, esemplificati da un collegamento tra la frammentazione del DNA libero da cellule e l'espressione genica46. Di conseguenza, la nostra conoscenza del cancro al seno è stata ampliata anche da approcci integrativi, che hanno portato a una comprensione più completa della malattia. Ad esempio, la sottoclassificazione prognostica dei tumori al seno è stata perfezionata e sono stati identificati nuovi antigeni tumore-specifici. È stato persino dimostrato che i dati molecolari integrati hanno un potere prognostico superiore rispetto ai livelli molecolari separati nel carcinoma mammario. Pertanto, nell'attuale progetto è pianificata un'analisi combinata dei livelli di dati genetici (ctDNA), trascrittomici (miRNA) e metabolomici nei campioni di sangue periferico per massimizzare il loro potenziale di biomarcatori articolari nel carcinoma mammario operabile.

Calcolo delle dimensioni del campione.

I ricercatori hanno eseguito i calcoli delle dimensioni del campione utilizzando il software SPSS Sample Power. Questi calcoli hanno dimostrato che 125 pazienti ad alto rischio dovrebbero essere sufficienti per fornire una potenza del test del log rank dell'80%, quando si testa il valore prognostico del rilevamento di ctDNA/CTC prima dell'intervento chirurgico. I calcoli della dimensione del campione erano basati sull'ipotesi qualificata che il tasso medio di sopravvivenza a 5 anni nel gruppo ad alto rischio fosse del 90%, mentre è del 75% e del 95% nei sottogruppi positivi e negativi di ctDNA/CTC, rispettivamente. Dei 125 pazienti stimati, 30 sono stati considerati positivi per ctDNA/CTC e 95 negativi.

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B. Migliorare il monitoraggio farmacologico del tamoxifene nel carcinoma mammario

Circa il 75% di tutti i tumori al seno appartiene ai sottotipi luminali, che esprimono i recettori ormonali Recettore degli estrogeni e Recettore del progesterone. Questi pazienti sono trattati con farmaci antiestrogenici; tamoxifene e/o inibitori dell'aromatasi. I due metaboliti più attivi del tamoxifene sono Z-4OHtam e Z-4OHNDtam (Z-endoxifene) hanno un'affinità 30-100 volte superiore per ER rispetto al tamoxifene. Questi metaboliti costituiscono in definitiva l'effetto bloccante a livello di ER che mira a sradicare la malattia micrometastatica e sono responsabili del miglioramento della sopravvivenza in seguito all'istituzione di questo trattamento sistemico adiuvante. La misurazione diretta di questi metaboliti aggira tutti i disturbi derivanti dalla diversità dell'attività del CYP2D6, vale a dire vie metaboliche alternative, aderenza al farmaco e inibizione delle interazioni farmacologiche. La nostra nuova metodologia LC/MS-MS tiene conto di tutte le variabili sopra menzionate e fornisce un rapporto di lettura funzionale del livello sierico dei metaboliti attivi del tamoxifene nel singolo paziente. Questo metodo può anche distinguere tra gli isomeri inattivi e attivi dell'endoxifene e del 4-OHtam, che sono i metaboliti più attivi del tamoxifene che bloccano l'ER. In collaborazione con l'Oslo Breast Cancer Research Group, i ricercatori hanno recentemente dimostrato in uno studio osservazionale retrospettivo che i pazienti con basse concentrazioni sieriche di Z-4OHtam < 3,26 nM o Z-Endoxifen < 9,00 nM (circa il 12% di tutti i pazienti) hanno un significativo sopravvivenza specifica e totale per carcinoma mammario peggiore rispetto alle pazienti con concentrazioni sieriche superiori a queste soglie (HR aggiustato = 4,3; CI95 = 1,9-13,6) (curve rosse nella figura 4). I pazienti con un livello molto elevato di questi metaboliti (circa il 12% dei pazienti) non avevano endpoint specifici per il seno Ora, i ricercatori devono convalidare questa scoperta in materiali di pazienti indipendenti. Se convalidato, questo sarà di beneficio clinico diretto per il 25% dei pazienti con carcinoma mammario ER + che pianificano il trattamento adiuvante con tamoxifene. Tale monitoraggio terapeutico dei farmaci (TDM) potrebbe identificare i pazienti a rischio con livelli inadeguati di metaboliti attivi del tamoxifene. Ciò potrebbe comportare un aumento della dose o il passaggio a una forma di trattamento endocrino alternativo in questi pazienti. I pazienti con livelli di metaboliti molto elevati possono continuare con il tamoxifene e non è necessario passare a un inibitore dell'aromatasi.

Pertanto, il TDM potrebbe rivelarsi un cambiamento paradigmatico nel trattamento endocrino tam del carcinoma mammario ER-positivo. È importante sottolineare che la distanza dalla "panca al letto" in questo studio è molto breve a causa delle nostre recenti scoperte, di un metodo fattibile e di oltre 30 anni di esperienza con il tamoxifene in ambito clinico.

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C. Microambiente tumorale nel carcinoma mammario - infiltrazione immunitaria stromale adiposa e interazione con il tumore nella zona di crescita

Sfondo: Il cancro al seno è ancora il tipo di cancro più comune tra le donne nel mondo occidentale, inclusa la Norvegia. Ogni anno vengono diagnosticati circa 3500 nuovi pazienti norvegesi con cancro al seno. Negli ultimi 50 anni, l'incidenza del cancro al seno in Norvegia è più che raddoppiata. È interessante notare che, nello stesso lasso di tempo, il sovrappeso e l'obesità sono aumentati in modo allarmante. La sottotipizzazione molecolare dei tumori del cancro al seno ha migliorato la comprensione della sua biologia intrinseca. Ciò ha aperto la strada a un approccio terapeutico più personalizzato e ha migliorato l'esito per le pazienti affette da cancro al seno negli ultimi 20 anni.

Oltre alla sottotipizzazione molecolare, oggi la diagnostica del carcinoma mammario consiste nella stadiazione (attraverso il sistema di classificazione TNM) e nell'esame microscopico da parte di un patologo. Vi è una crescente evidenza del valore prognostico della valutazione del microambiente tumorale (ad es. linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL)) come parte della diagnostica nel cancro al seno, ma finora questo non è implementato nella pratica clinica. Un numero elevato di TIL è fortemente associato a una buona prognosi nei pazienti con carcinoma mammario triplo negativo, ma non ha mostrato alcuna correlazione di questo tipo nel carcinoma mammario luminale. I macrofagi nel tessuto adiposo mammario si differenziano in due distinti fenotipi, spesso classificati come M1 e M2 con un aumento di quest'ultimo nel carcinoma mammario. M1 attacca e fagocita le cellule tumorali, mentre M2 ha proprietà antinfiammatorie e ha dimostrato di avere funzioni di promozione del tumore.

Il presente progetto aumenterà la nostra conoscenza dell'interazione tra il tumore mammario primario e l'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo juxta-tumorale. I nostri risultati saranno correlati ai sottotipi molecolari di carcinoma mammario, alla vicinanza al tumore, ai marcatori di proliferazione e, infine, all'esito clinico. I ricercatori ritengono che questa conoscenza fornirà nuovi bersagli predittivi per la terapia adiuvante del cancro immunomodulante. Questo progetto di dottorato ha tre pacchetti di lavoro correlati (WP) con l'obiettivo finale di identificare i marcatori di infiammazione nel tessuto adiposo juxta-tumorale che sono rilevanti nella valutazione clinica della terapia adiuvante del cancro al seno. Nel WP 1 e 2, sarà caratterizzato il paesaggio fenotipico e genomico del tessuto adiposo juxta-tumorale, e nel WP 3 le ricerche indagheranno se questa conoscenza può predire l'esito clinico.

Il progetto si basa su una forte collaborazione regionale tra l'Haukeland University Hospital (HUH) e lo Stavanger University Hospital (SUH). Per il progetto in corso, le ricerche hanno raccolto in modo sistematico tessuto adiposo e tumorale da 30 pazienti con carcinoma mammario consecutive sottoposte a mastectomia al SUH. I prelievi chirurgici della mammella vengono senza indugio inoltrati al patologo che, sotto controllo morfologico, preleva il tessuto rilevante dal fronte invasivo e dal core (0,5x1x1 cm) del tumore primitivo. I controlli da tessuto mammario normale (2000 mg) dal quadrante controlaterale distante saranno raccolti e verificati morfologicamente dal patologo. Il tessuto viene raccolto in coppie di duplicati. Uno dei campioni viene immediatamente congelato a scatto in azoto liquido per la conservazione, mentre l'altra metà di ogni coppia viene conservata in formalina e fissata in paraffina (FFPE). Inoltre, tre coppie di campioni di tessuto adiposo (ciascuno di 1x1x1 cm) con distanza crescente dal bordo tumorale costituiranno un gradiente di tessuto adiposo dal fronte invasivo dell'area tumorale. I gradienti raccolti vengono anche immediatamente congelati in azoto liquido e metà di ciascuna coppia viene conservata come FFPE. I ricercatori hanno eseguito uno studio pilota che conferma una resa di RNA sufficiente dai campioni di tessuto congelato per il sequenziamento dell'RNA.

Il tessuto viene raccolto come parte della biobanca di ricerca generale, Prospective Breast Cancer Biobank (PBCB) (REK# 2010/1957), un progetto di biobanca in corso.

La coorte retrospettiva di Stavanger è composta da tutte le pazienti con carcinoma mammario a cui è stato diagnosticato un carcinoma mammario invasivo di prima insorgenza presso il dipartimento di patologia, ospedale universitario di Stavanger, tra il 1993 e il 2004. Poiché SUH è l'unico ospedale della regione, questa è una vera biobanca basata sulla popolazione, sono già inclusi dati clinicopatologici come: classificazione, stadio, TNM, marcatori di trattamento e proliferazione (Ki-67, PPH3/MAI); l'ultimo follow-up clinico è avvenuto nel 2016.

Le ricerche hanno quattro ipotesi principali relative all'infiammazione e all'infiltrazione di cellule immunitarie nel carcinoma mammario:

1. Il tessuto adiposo juxta-tumorale vicino al bordo del tumore mostra un aumento del livello di infiammazione e di infiltrazione delle cellule immunitarie.
2. L'infiammazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie si attenuano con l'aumentare della distanza dal bordo del tumore.
3. Esistono differenze nell'infiammazione e nell'infiltrazione delle cellule immunitarie tra i diversi sottotipi di carcinoma mammario (luminale A, luminale B e basale).
4. L'aumento dell'infiammazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie sono correlate a esiti clinici avversi (ad es. recidiva della malattia).

4.1 DISEGNO, METODI E ANALISI DELLO STUDIO

Le ricerche hanno quattro ipotesi principali relative all'infiammazione e all'infiltrazione di cellule immunitarie nel carcinoma mammario:

1. Il tessuto adiposo juxta-tumorale vicino al bordo del tumore mostra un aumento del livello di infiammazione e di infiltrazione delle cellule immunitarie.
2. L'infiammazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie si attenuano con l'aumentare della distanza dal bordo del tumore.
3. Esistono differenze nell'infiammazione e nell'infiltrazione delle cellule immunitarie tra i diversi sottotipi di carcinoma mammario (luminale A, luminale B e basale).
4. L'aumento dell'infiammazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie sono correlate a esiti clinici avversi (ad es. recidiva della malattia).

WP 1: MAPPATURA MORFOLOGICA E GENOMICA DELL'INFILTRAZIONE DI CELLULE IMMUNITARIE NEL TESSUTO ADIPOSO CHE CIRCONDA IL CARCINOMA DELLA MAMMELLA

Sfondo: L'infiammazione è un importante facilitatore per lo sviluppo del tumore (16). È stato dimostrato che il tessuto adiposo vicino al cancro al seno ha una maggiore infiltrazione di cellule immunitarie, ma non è ancora noto come ciò sia correlato ai sottotipi molecolari e/o alla vicinanza al tumore. Le ricerche utilizzeranno l'IHC e il sequenziamento dell'RNA per valutare il livello di infiammazione, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e le firme di espressione genica immunitaria nel tessuto adiposo che circonda il cancro al seno.

Disegno: studio esplorativo prospettico Pazienti, materiale e calcolo della potenza: il tessuto adiposo viene raccolto dai campioni di mastectomia raccolti in modo prospettico. I campioni di tessuto vengono raccolti da tre diversi sottogruppi molecolari (luminale A, luminale B e basale come il cancro al seno), 10 in ciascun gruppo. Le biopsie del nucleo vengono raccolte in un gradiente con l'aumentare della distanza dal bordo del tumore (fig. 1). Il Norwegian Genomics Consortium (NGC) ha confermato che le dimensioni del campione basate sulla selezione in specifici sottotipi di cancro al seno sono sufficienti per la potenza statistica.

Metodi: I vetrini di tessuto tumorale, anteriore invasivo e tessuto adiposo fissati in formalina (fig. 1) saranno colorati utilizzando IHC e anticorpi contro le cellule immunitarie (cellule immunitarie totali, CD45; cellule T, CD3, CD8, FoxP3; cellule mieloidi, CD68 , HLA-DR). I vetrini saranno valutati al microscopio e i risultati saranno correlati a sottogruppi molecolari di carcinoma mammario, localizzazione in relazione a marcatori tumorali e di proliferazione (es. Ki67, PPH3 e MAI). Parallelamente, le ricerche eseguiranno il sequenziamento dell'RNA su tessuto congelato prelevato dagli stessi campioni di tessuto sopra descritti. Diversi approcci di analisi saranno utilizzati sui dati RNAseq. Fatta eccezione per l'analisi dei dati, algoritmi di analisi specifici che includono la deconvoluzione delle cellule immunitarie (ABIS, CIBERSORTx) e più specificamente l'esame delle firme immunitarie del tumore (analisi TIP), tra gli altri.

Risultato atteso: le ricerche si aspettano di trovare un aumento dell'infiammazione e dell'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo juxta-tumorale e un'espressione alterata delle firme geniche infiammatorie che le ricerche possono approfondire nel WP 2.

WP 2: VALUTAZIONE DELLA REAZIONE INFIAMMATORIA NEL TESSUTO ADIPOSO JUXTA-TUMORALE NEL CANCRO DELLA MAMMELLA UTILIZZANDO L'IMMUNOISTOCHIMICA E LA CITOMETRIA DI MASSA PER IMAGING.

Sfondo: le cellule del cancro al seno interagiscono con il tessuto circostante e provocano infiammazione e infiltrazione di cellule immunitarie nel tumore e nel tessuto adiposo. L'imaging della citometria di massa ha dimostrato che l'infiltrazione di cellule immunitarie nei tumori è correlata alla prognosi, ma non ci sono ancora studi che esaminino se il tessuto adiposo che circonda il tumore mostri anche modelli strutturali di infiltrazione di cellule immunitarie. Pertanto, le ricerche esamineranno il tessuto adiposo che circonda i tumori del cancro al seno utilizzando la citometria di massa per imaging Hyperion™.

Disegno: studio prospettico esplorativo Pazienti, materiale e calcolo della potenza: i campioni di tessuto vengono raccolti da 30 campioni di mastectomia ottenuti in modo prospettico con tre diversi sottogruppi molecolari (luminale A, luminale B e basale come carcinoma mammario), 10 in ciascun gruppo. Il tessuto adiposo viene raccolto in un gradiente lontano dal tumore e dal quadrante controlaterale come campione di controllo (fig. 2). Un campione di 30 pazienti è ritenuto sufficiente per uno studio esplorativo di questo tipo.

Metodi: un pannello Hyperion™ IMC di un massimo di 50 anticorpi unici sarà sviluppato sulla base di un pannello già esistente e convalidato disponibile presso la struttura principale dell'UoB che i ricercatori hanno precedentemente utilizzato con successo in altri progetti. Il pannello disponibile sarà ulteriormente ampliato sulla base dei risultati del WP 1 e prima convalidato su campioni di tessuto mammario "non essenziali" prima di essere utilizzato sui campioni di studio sopra descritti. Utilizzando Hyperion™ IMC le ricerche intendono analizzare i livelli di reazione infiammatoria nel tessuto adiposo juxta-tumorale. I dati IMC saranno analizzati con histoCAT+, MAV e FlowJo (tipicamente utilizzati per l'analisi dei dati di citometria a flusso ma anche altamente adatti per l'analisi di immagini ad alto parametro). Inoltre, le ricerche potranno utilizzare dati di espressione genica di fattori noti e nuovi, identificati nel WP 1, e visualizzare se l'espressione è generalizzata o compartimentata nel tessuto adiposo. Il tessuto mammario adiposo normale del quadrante controlaterale verrà utilizzato come controllo. Per esaminare più in dettaglio l'influenza del BC sull'infiammazione del tessuto adiposo iuxtatumorale dei vari sottotipi molecolari, le ricerche intendono anche colorare il tessuto di tre segmenti di tessuto che si estendono dal tumore per determinare se i livelli dipendono da la distanza dal tumore o dal sottotipo molecolare (Fig. 1). L'infiammazione nel tessuto adiposo juxtatumorale sarà valutata anche morfologicamente mediante IHC. Questo ci consentirà di selezionare le regioni di interesse da indagare utilizzando IMC.

Risultato atteso: le ricerche prevedono di trovare un aumento dell'infiammazione e dell'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo vicino al tumore e di identificare nuovi biomarcatori nel tessuto adiposo che consentano di indagare sul significato clinico nel WP 3.

WP 3: REAZIONE INFIAMMATORIA NEL TESSUTO ADIPOSO JUXTA-TUMORALE NEL CANCRO DELLA MAMMELLA ED ESITO CLINICO.

Sfondo:

L'immunoistochimica è una pietra miliare nella diagnostica del cancro al seno e funge da modalità principale per l'identificazione di sottogruppi molecolari di cancro al seno e marcatori di proliferazione come Ki-67. Questo è essenziale per determinare quale regime di trattamento è più adatto per il particolare paziente. L'eterogeneità nel tessuto tumorale (sia cellule tumorali che cellule immunitarie infiltranti) è stata collegata alla differenza nell'esito clinico, ma non è ancora noto se lo stesso vale per il tessuto adiposo che circonda il tumore. Pertanto, le ricerche esamineranno il tessuto adiposo juxta-tumorale per l'infiammazione e l'infiltrazione di cellule immunitarie e correleranno questo con l'esito clinico nei pazienti con carcinoma mammario.

Disegno: studio osservazionale clinico

Pazienti e metodi: un numero di 3500 pazienti con carcinoma mammario sono accumulati in una biobanca con un tempo medio di follow-up di 15 anni. Un'ampia selezione di campioni di tessuto di questi pazienti sarà valutata rispetto alle cellule immunitarie nel tessuto adiposo e ai biomarcatori scoperti nei WP 1 e 2 utilizzando IHC. I campioni saranno stratificati in tre gruppi in base a sottogruppi molecolari (es. Luminale A, Luminale B e Basale come il cancro al seno). I vetrini di tessuto saranno analizzati ei risultati correlati con l'esito clinico dalle riviste dei pazienti (l'accesso alle riviste è già approvato da REK). Utilizzando l'hazard ratio proporzionale di Cox e il log-rank test, le ricerche valuteranno l'effetto che l'aumento dell'infiammazione nel tessuto adiposo ha sulla sopravvivenza del paziente.

Calcolo della potenza: le ricerche hanno stimato la potenza del test della differenza nella sopravvivenza libera da recidiva tra i pazienti positivi e negativi per l'infiammazione juxta tumorale valutata da IHC e IMC. La misura dell'effetto è l'hazard rate (HR) calcolato con il metodo di regressione di Cox. Ad esempio: 1000 pazienti con un tasso di recidiva del 15% avranno creato almeno 150 endpoint. Se il tasso di infiammazione è del 20%, le ricerche avranno un potere dell'80% per rilevare una differenza di sopravvivenza con un rapporto di rischio (HR) di 1,80 o superiore.

Risultato atteso: Quest'ultimo pacchetto di lavoro è progettato per dare prova di principio che è fattibile incorporare l'esame istologico del tessuto adiposo juxta-tumorale come parte della diagnostica del cancro al seno. In una prospettiva più lunga le ricerche mirano a identificare nuovi biomarcatori specifici di infiltrazione immunitaria nel tessuto adiposo che correlano all'esito avverso nei pazienti con carcinoma mammario. Tali biomarcatori possono servire come strumenti predittivi per identificare i pazienti idonei per il trattamento antinfiammatorio o immunomodulante adiuvante.

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D. Monitorare gli effetti collaterali, la QoL, la depressione, l'affaticamento e la partecipazione alla vita lavorativa Background

Il trattamento del cancro al seno impiega tutta la chirurgia, la chemioterapia, la radioterapia e varie opzioni terapeutiche mirate come la terapia con antiestrogeni e anti HER-2. Queste opzioni di trattamento creano fastidiosi effetti collaterali sia a breve che a lungo termine. È importante sottolineare che recentemente sono state scoperte relazioni più complesse tra le modalità di terapia oncologica e i disturbi di salute soggettivi nei pazienti con carcinoma mammario. I punteggi di affaticamento, ansia e depressione sono probabilmente letture funzionali del carico totale del trattamento. Il trattamento antitumorale ha anche un impatto sostanziale sulla qualità della vita e sugli aspetti sociali per i sopravvissuti al cancro che si estende alla partecipazione alla vita lavorativa. Il congedo per malattia (LS) cinque anni dopo la diagnosi di cancro al seno dipende più da fattori sociali che dalla malattia (2). Quindi, il cancro al seno colpisce le donne due volte; prima il carico di malattia poi le preoccupazioni sosio-economiche. In uno studio retrospettivo basato su registri, le sopravvissute al cancro al seno hanno un rischio quasi 3 volte maggiore di ricevere una pensione di invalidità (DP) rispetto alle pazienti senza cancro (3). Tuttavia, questo studio era basato su regimi terapeutici oncologici per lo più abbandonati.

Obiettivi

Lo scopo di questo studio è identificare i fattori di rischio per diventare un ricevitore SL, WAA o DP a lungo termine mediante un'analisi qualitativa approfondita e un approccio a metodo misto triangolando i dati PROM, i dati clinici/biologici e i dati NAV. L'uso dei dati NAV come endpoint fornirà preziose informazioni ai medici e ai medici generici che potrebbero ottimizzare il follow-up anche per quanto riguarda la partecipazione alla vita lavorativa. Pertanto, i ricercatori hanno un solido disegno di studio per identificare i fattori fisk per tassi elevati di SL, WAA e DP. In definitiva, gli investigatori mirano a ridurre le spese finanziarie che il cancro al seno genera per la società.

Progettazione dello studio / materiali e metodi.

Il disegno dello studio è uno studio osservazionale in cui i ricercatori nel presente studio mapperanno i tassi e i fattori denty fisk per SL, WAA e DP elevati tra i sopravvissuti al cancro al seno con i programmi di trattamento aggiornati. Gli investigatori seguiranno un approccio traslazionale in 4 fasi:

1. Gli investigatori condurranno prima uno studio qualitativo esplorativo utilizzando l'analisi documentale della politica sanitaria e della vita lavorativa nel contesto norvegese, combinata con dati empirici provenienti da interviste semi-strutturate e focus group con 20 pazienti ad alto rischio) da analizzare tematicamente. Il quadro teorico per questo progetto qualitativo deriva dall'interazionismo simbolico in cui scoprire e comprendere il significato in contesti specifici è un obiettivo. Poiché le interazioni sociali e professionali significative sono importanti per la riabilitazione psicosociale degli individui con cancro al seno, l'interazionismo simbolico è un quadro metodologico appropriato. Questo approccio qualitativo creerà le basi dell'approccio negli studi basati su PROM e orientati al database NAV di seguito.

2. Dati NAV

   Gli investigatori attualmente collaborano con la vice direttrice Anneline Christine Teigen e il consulente senior Günter Olsborg in NAV-Rogaland e la sezione Mikrodata presso Statistics Norway (SSB). Lo scopo di questa collaborazione è acquisire maggiori conoscenze sull'uso dei servizi di sicurezza sociale tra i malati di cancro al seno insieme agli esperti NAV-Rogaland e insieme a SSB utilizzare il database FD-trygd per ottenere dati sociodemografici prospettici affidabili sui SL (sia a breve che a lungo termine), Work Assessment Allowance (WAA) (Arbeidsavklaringspenger) e PS (entrambi a tempo limitato

   e per tutta la vita) per ciascun paziente nel presente studio PerMoBreCan.

3. I dati relativi alla misura dell'esito riportato dal paziente (PROM) sono ottenuti al basale e successivamente ogni anno da tutti i pazienti PerMoBreCan. I dati PROM sono costituiti da strumenti 1.HRQoL (EORTC QLQ-C30, EORTC QLQ-BR23 e FACT B), 2.Hospital Anxiety and Depression Scale, HAD, 3. Fatigue instruments Fatique Impact Scale, FIS; Fatugue Severity Scale (FSS) e VAS-affaticamento, 4. Questionari sugli effetti collaterali, 5. Questionario sul dolore articolare, 6. L'incertezza di Mishel nella scala della malattia, MUIS; e 7. Questionario sulle abitudini alimentari e il questionario 8.ROMA III sui disturbi intestinali (IBD e IBS).
4. Identificazione di biomarcatori.

Tutti i pazienti che parteciperanno a questo studio saranno sottoposti a screening sui biomarcatori circolanti legati alla fatica. Questi biomarcatori sono a livello proteico, a livello di espressione genetica e anche a livello epigenetico. La nostra lunga e piacevole collaborazione con il prof. Roald Omdal dello Stavanger University Hospital, che è un immunologo clinico e ricercatore sulla fatica transalzionale, è impegnato a condurre queste analisi nel suo laboratorio di ricerca.