Prospektywne biobankowanie raka piersi (PBCB)

A. Wczesne wykrywanie nawrotów systemowych w raku piersi.

WP 1. Analiza guza pierwotnego.

Analiza guza pierwotnego i przerzutów (grupa Patologia). W tym pakiecie roboczym zarówno DNA, jak i RNA z guzów pierwotnych 125 pacjentów wysokiego ryzyka (Luminal-B) zostaną przeanalizowane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Ponadto badacze przeanalizują również DNA i RNA z dostępnych zmian przerzutowych (obecnie materiał dostępny dla 3/8), które się pojawiły i pojawią w okresie badania.

MiRNA i mRNA będą profilowane przy użyciu zestawu PureLink™ miRNA Isolation Kit (Invitrogen), Dynabeads mRNA direct micro kit (Ambion)) i zestawu Ion total RNA-seq V2 (Life Technologies) na naszym aparacie Ion Proton NGS. Analizy bioinformatyczne sparowanych profili ekspresji mRNA i mikroRNA zostaną wykorzystane do ujawnienia zróżnicowanej ekspresji mikroRNA między pacjentami z i bez nawrotów w trakcie leczenia. Dane te zostaną powiązane z naszymi poprzednimi badaniami i wykorzystane do identyfikacji docelowych kandydatów do analizy mikroRNA w egzosomach i TEP.

Ponadto NGS zostanie również przeprowadzony na DNA z guzów pierwotnych i przerzutów w celu weryfikacji mutacji DNA, zwłaszcza w ER i innych znanych onkogenach, w tym badanych w WP3. Sekwencjonowanie DNA zostanie przeprowadzone przy użyciu kompleksowego testu Oncomine. Jest to podejście oparte na amplikonie, analizujące hotspoty SNV, indele i CNV. Analizy te zapewnią nam biologiczne zrozumienie i podstawową wiedzę na temat każdego pojedynczego guza, a te zestawy danych można również porównać z ostatnio opublikowanymi danymi.

WP 2. Krążące komórki nowotworowe (CTC).

Krążące komórki nowotworowe (grupa onkologiczna) Krążące komórki nowotworowe są wzbogacane z próbek krwi obwodowej poprzez wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie zmniejszenie immunomagnetyczne leukocytów. Grupa onkologów niedawno opracowała i opublikowała nową metodę wyczerpywania, nazwaną MINDEC (Multi-marker Immuno-magnetic Negative Depletion Enrichment of CTCs), która charakteryzuje się doskonałymi wskaźnikami odzyskiwania i wzbogacania. RNA i DNA są izolowane jednocześnie ze wzbogaconej frakcji, aby umożliwić wykrywanie CTC zarówno metodami opartymi na RNA, jak i DNA. Specyficzne markery mRNA, o wysokim poziomie w komórkach nowotworowych i niskim poziomie w normalnych leukocytach, są wstępnie amplifikowane i oznaczane ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym jako markery zastępcze dla CTC. Zarówno markery specyficzne dla nabłonka, jak i markery związane z przejściem mezenchymalnym nabłonka są częścią panelu markerów. Do tej pory badacze przeanalizowali 170 kolejnych próbek krwi z większej kohorty PBCB, wzbogaconych procedurą MINDEC i znaleźli dowody na CTC w około 20% próbek (zarówno od pacjentów niskiego, jak i wysokiego ryzyka). kontynuować ten projekt. Badacze przeanalizowali również próbki krwi od 30 zdrowych ochotniczek dla porównania. Analizie poddane zostaną wszystkie pobrane próbki krwi od 125 pacjentów z grupy wysokiego ryzyka (około 575 próbek). Obecność lub poziom CTC w analizowanych próbkach zostanie później porównany ze znanymi czynnikami prognostycznymi, efektem leczenia i przebiegiem choroby.

WP 3. krążące DNA guza (ctDNA).

Mutacje specyficzne dla nowotworu można wykorzystać jako markery ctDNA, ponieważ nie są one obecne w normalnych komórkach i normalnym DNA osocza. Grupa onkologów niedawno wykazała znaczenie kliniczne pomiarów ctDNA w raku trzustki. Badacze będą teraz mierzyć poziomy ctDNA w próbkach osocza od pacjentów z rakiem piersi wysokiego ryzyka poprzez ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji. Niedawno udostępniony test „Oncomine breast cfDNA assay” (Thermo Fisher) zostanie wykorzystany do wykrywania mutacji w panelu dziesięciu genów, które często ulegają mutacjom w raku piersi. Test opiera się na molekularnym kodowaniu kreskowym matryc i umożliwia powtarzalne wykrywanie mutacji do 0,1% próbek kontrolnych. Biorąc pod uwagę niskie stężenie wolnego od komórek DNA (=cfDNA) w osoczu (zwykle 10 ng na ml krwi), czułość 0,1% uważa się za wystarczającą. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone na naszym instrumencie Ion Proton NGS (Life Technologies). W tym WP zostaną przeanalizowane przedoperacyjne próbki krwi i coroczne próbki kontrolne od 125 pacjentów wysokiego ryzyka. Próbki krwi od 30 zdrowych ochotniczek zostały już pobrane i zostaną przeanalizowane dla porównania.

Obecność i poziom mutacji specyficznych dla guza zostaną przeanalizowane w odniesieniu do efektu leczenia i wyniku choroby. Profil mutacji w biopsji guza pierwotnego i próbkach osocza zostanie porównany w celu ujawnienia potencjalnej heterogeniczności. Ponadto zmiany podłużne w profilu mutacji ctDNA zostaną porównane z rozwojem choroby, aby potencjalnie rzucić nieco światła na mechanizmy biologiczne powodujące oporność na leczenie lub późne nawroty choroby.

WP 4. mikroRNA (miRNA)

Krążące mikroRNA z egzosomów i TEP (grupa patologii) Całkowity RNA zostanie wyizolowany z egzosomów i TEP z próbek krwi pobranych przed iw trakcie leczenia. Badacze opracowali niedawno metody izolacji całkowitego RNA z egzosomów (za pomocą zestawu exoRNeasy serum Plasma (Qiagen) i zestawu do izolacji miRCURY RNA (Exiqon)) oraz TEP. Stosując wspomniany protokół, całkowity RNA z egzosomów został już wyizolowany od wszystkich 125 pacjentów wysokiego ryzyka podczas pierwszej wizyty/przed leczeniem, dodatkowo z ostatnich próbek krwi pobranych od tych pacjentów całkowity RNA zostanie wyizolowany zarówno z egzosomów, jak i TEP. Ponadto profil mikroRNA zostanie wykonany na wyizolowanym RNA przy użyciu potoku i platformy już ustanowionych dla naszego instrumentu Ion Proton. Profile te zostaną porównane z bioinformatyczną analizą profili mRNA-miRNA z guza pierwotnego (WP1) i próbek pobranych przed leczeniem. MikroRNA, które nie są obecne w próbce tkanki i/lub próbce krwi przed leczeniem, ale pojawiają się we krwi tuż przed pojawieniem się nawrotu, można następnie retrospektywnie prześledzić w poprzednich próbkach krwi, aby zobaczyć, jak czułe są te mikroRNA w przewidywaniu leczenia opór. Profil mikroRNA z TEP zostanie porównany z profilem mikroRNA z egzosomów i z profilami mRNA-miRNA z guza pierwotnego (WP1), aby sprawdzić, czy TEP odzwierciedlają guz i czy mają potencjał przewidywania nawrotu.

WP 5. Metabolomika

Metabolomika to nauka o małych cząsteczkach składających się z substratów, półproduktów i produktów końcowych metabolizmu komórkowego, takich jak aminokwasy, cukry i małe kwasy organiczne. Stan metaboliczny komórek rakowych jest zasadniczo zmieniony w porównaniu z normalnymi komórkami, co można wykorzystać do celów diagnostycznych. Specyficzne sygnatury metaboliczne z tkanki nowotworowej dostarczają dodatkowych informacji do określenia podtypów raka piersi i przewidywania wyniku1. Na przykład zwiększone poziomy mleczanu i glicyny w guzie są związane ze złymi rokowaniami u pacjentów z rakiem z dodatnim receptorem estrogenowym (ER). Analizy metaboliczne guzów pierwotnych wykazały również wartość predykcyjną w odniesieniu do leczenia neoadiuwantowego pacjentów z miejscowo zaawansowaną chorobą.

Wykazano również, że krążące metabolity dostarczają informacji prognostycznych w operacyjnym raku piersi i dalej stratyfikują ryzyko w ramach istniejących genetycznie określonych kategorii ryzyka. Co ważne, zmiany metaboliczne mogą wynikać bezpośrednio lub pośrednio z choroby mikroprzerzutowej, a nie z guza pierwotnego. Niedawno badacze wykazali, że ogólnoustrojowe poziomy mleczanu i pirogronianu przewidują gorsze rokowanie u pacjentów z operacyjnym rakiem piersi ER-dodatnim. Tkanka przylegająca do guza i reakcje immunologiczne mogą również przyczyniać się do zmienionego profilu metabolicznego. Istnieją również dowody na to, że profilowanie metaboliczne może być wykorzystywane do monitorowania pacjentów w przypadku niektórych nowotworów, chociaż nadal brakuje takich dowodów w przypadku raka piersi. Dlatego badacze zamierzają zbadać, czy monitorowanie pooperacyjne za pomocą profilowania metabolicznego we krwi jest przydatne we wczesnym wykrywaniu nawrotu raka piersi.

WP 6. Integracyjne monitorowanie molekularne do wykrywania nawrotów

Nowa technologia zrewolucjonizowała poziom informacji biologicznych, które można uzyskać z próbek klinicznych, reprezentowanych przez nowe terminy „omika” genomika, transkryptomika, metabolomika itp. Dostępność tak dużych zbiorów danych, nawet w domenie publicznej, zachęciła do opracowania metod integracyjnych, które mogą wydobywać istotne informacje z wielu połączonych źródeł danych. Takie podejście ujawniło zaskakujące nowe połączenia między zbiorami danych omicznych, czego przykładem jest związek między fragmentacją DNA bez komórek a ekspresją genów46. W związku z tym nasza wiedza na temat raka piersi została również poszerzona o podejście integracyjne, co zaowocowało pełniejszym zrozumieniem choroby. Na przykład udoskonalono prognostyczną podklasyfikację raków piersi i zidentyfikowano nowe antygeny specyficzne dla nowotworu. Wykazano nawet, że zintegrowane dane molekularne mają większą moc prognostyczną niż oddzielne poziomy molekularne w raku piersi. W związku z tym w obecnym projekcie planowana jest połączona analiza poziomów danych genetycznych (ctDNA), transkryptomicznych (miRNA) i metabolomicznych w próbkach krwi obwodowej, aby zmaksymalizować ich wspólny potencjał biomarkerów w operacyjnym raku piersi.

Obliczenia wielkości próbki.

Badacze przeprowadzili obliczenia wielkości próbki za pomocą oprogramowania SPSS Sample Power. Obliczenia te wykazały, że 125 pacjentów wysokiego ryzyka powinno wystarczyć do uzyskania mocy testu logarytmicznego rang na poziomie 80%, podczas testowania wartości prognostycznej wykrywania ctDNA/CTC przed operacją. Obliczenia liczebności próby oparto na kwalifikowanym założeniu, że średni wskaźnik przeżycia 5-letniego w grupie wysokiego ryzyka wynosi 90%, podczas gdy odpowiednio 75% i 95% w podgrupach ctDNA/CTC-dodatnich i ujemnych. Spośród szacowanych 125 pacjentów, 30 uznano za pozytywne w kierunku ctDNA/CTC, a 95 za negatywne.

-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----

B. Poprawa monitorowania leków tamoksyfenu w raku piersi

Około 75% wszystkich raków piersi należy do podtypów luminalnych, które wykazują ekspresję receptorów hormonalnych Receptor estrogenowy i Receptor progesteronowy. Pacjenci ci są leczeni lekami antyestrogenowymi; tamoksyfen i/lub inhibitory aromatazy. Dwa najbardziej aktywne metabolity tamoksyfenu to Z-4OHtam i Z-4OHNDtam (Z-endoksyfen) mają 30-100 razy większe powinowactwo do ER niż tamoksyfen. Te metabolity ostatecznie stanowią efekt blokujący na poziomie ER, mający na celu wyeliminowanie choroby mikroprzerzutowej i są odpowiedzialne za poprawę przeżycia po wprowadzeniu tego uzupełniającego leczenia ogólnoustrojowego. Bezpośredni pomiar tych metabolitów pozwala ominąć wszelkie zakłócenia wynikające z różnorodności aktywności CYP2D6, tj. alternatywnych szlaków metabolicznych, przylegania do leku i hamowania interakcji lekowych. Nasza nowatorska metodologia LC / MS-MS uwzględnia wszystkie wyżej wymienione zmienne i zapewnia funkcjonalny raport odczytu poziomu aktywnych metabolitów tamoksyfenu w surowicy u indywidualnego pacjenta. Ta metoda umożliwia również rozróżnienie nieaktywnych i aktywnych izomerów endoksyfenu i 4-OHtamu, które są najbardziej aktywnymi metabolitami blokującymi ER tamoksyfenu. We współpracy z Oslo Breast Cancer Research Group badacze wykazali ostatnio w retrospektywnym badaniu obserwacyjnym, że pacjenci z niskim stężeniem Z-4OHtam w surowicy < 3,26 nM lub Z-Endoksyfen < 9,00 nM (około 12% wszystkich pacjentek) mają istotne gorsze przeżycie specyficzne i całkowite dla raka piersi niż pacjentki ze stężeniami w surowicy powyżej tych progów (skorygowany HR = 4,3; CI95 = 1,9-13,6) (czerwone krzywe na rysunku 4). Pacjenci z bardzo wysokim poziomem tych metabolitów (około 12% pacjentek) nie mieli punktów końcowych specyficznych dla piersi. Teraz badacze muszą zweryfikować to odkrycie w niezależnych materiałach pacjentów. Jeśli zostanie to potwierdzone, będzie to bezpośrednią korzyścią kliniczną dla 25% pacjentek z rakiem piersi na ostry dyżur i planujących uzupełniające leczenie tamoksyfenem. Takie terapeutyczne monitorowanie leków (TDM) mogłoby identyfikować pacjentów z grupy ryzyka z niewystarczającymi poziomami aktywnych metabolitów tamoksyfenu. Może to prowadzić do zwiększenia dawki lub przejścia na alternatywną formę leczenia hormonalnego u tych pacjentów. Pacjenci z bardzo wysokimi poziomami metabolitów mogą kontynuować leczenie tamoksyfenem i nie muszą przechodzić na inhibitor aromatazy.

Tak więc TDM może okazać się paradygmatyczną zmianą w leczeniu endokrynologicznym raka piersi ER-dodatniego. Co ważne, odległość od „ławy do łóżka” w tym badaniu jest bardzo krótka ze względu na nasze ostatnie odkrycia, wykonalną metodę i ponad 30-letnie doświadczenie z tamoksyfenem w warunkach klinicznych.

-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----

C. Mikrośrodowisko guza w raku piersi – naciek immunologiczny tkanki tłuszczowej zrębu i interakcja z guzem w strefie wzrostu

Tło: Rak piersi jest nadal najczęstszym rodzajem raka wśród kobiet w krajach zachodnich, w tym w Norwegii. Rocznie diagnozuje się około 3500 nowych pacjentek z rakiem piersi w Norwegii. W ciągu ostatnich 50 lat częstość występowania raka piersi w Norwegii wzrosła ponad dwukrotnie. Co ciekawe, w tym samym czasie nadwaga i otyłość niepokojąco wzrosły. Podtypy molekularne nowotworów piersi poprawiły zrozumienie jego wewnętrznej biologii. Otworzyło to drogę do bardziej spersonalizowanego podejścia do leczenia i poprawiło wyniki leczenia pacjentów z rakiem piersi w ciągu ostatnich 20 lat .

Oprócz określania podtypów molekularnych diagnostyka raka piersi polega obecnie na ocenie stopnia zaawansowania (poprzez system klasyfikacji TNM) i badaniu mikroskopowym przez patologa. Istnieje coraz więcej dowodów na wartość prognostyczną oceny mikrośrodowiska guza (np. limfocytów naciekających guz (TILs) jako element diagnostyki raka piersi, jak dotąd nie jest to jednak wdrażane w praktyce klinicznej. Duża liczba TIL jest silnie związana z dobrym rokowaniem u pacjentów z potrójnie ujemnym rakiem piersi, ale nie wykazała takiej korelacji w przypadku raka luminalnego piersi. Makrofagi w tkance tłuszczowej piersi różnicują się w dwa odrębne fenotypy, często klasyfikowane jako M1 i M2, ze wzrostem tego ostatniego w raku piersi. M1 atakuje i fagocytuje komórki rakowe, podczas gdy M2 ma właściwości przeciwzapalne i wykazano, że pełni funkcje promujące nowotwór.

Obecny projekt zwiększy naszą wiedzę na temat interakcji między pierwotnym guzem piersi a naciekiem komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej przy guzie. Nasze odkrycia zostaną skorelowane z molekularnymi podtypami raka piersi, bliskością guza, markerami proliferacji i ostatecznie z wynikami klinicznymi. Ten projekt doktorancki obejmuje trzy powiązane ze sobą pakiety robocze (WP), których ostatecznym celem jest identyfikacja markerów stanu zapalnego w tkance tłuszczowej przylegającej do guza, które są istotne w ocenie klinicznej terapii uzupełniającej raka piersi. W WP 1 i 2 zostanie scharakteryzowany krajobraz fenotypowy i genomowy tkanki tłuszczowej w okolicy guza, aw WP 3 naukowcy zbadają, czy ta wiedza może przewidzieć wynik kliniczny.

Projekt opiera się na silnej współpracy regionalnej między Szpitalem Uniwersyteckim Haukeland (HUH) a Szpitalem Uniwersyteckim w Stavanger (SUH). Na potrzeby obecnego projektu naukowcy w systematyczny sposób pobrali tkankę tłuszczową i tkankę nowotworową od 30 kolejnych pacjentek z rakiem piersi poddawanych mastektomii w SUH. Wycinki chirurgiczne piersi są niezwłocznie przekazywane patologowi, który pod kontrolą morfologiczną pobiera odpowiednią tkankę z frontu inwazyjnego i rdzenia (0,5x1x1 cm) guza pierwotnego. Kontrole z normalnej tkanki piersi (2000 mg) z odległego przeciwległego kwadrantu również zostaną zebrane i zweryfikowane morfologicznie przez patologa. Tkanka jest zbierana w podwójnych parach. Jedna z próbek jest natychmiast zamrażana w ciekłym azocie w celu konserwacji, podczas gdy druga połowa każdej pary jest konserwowana w formalinie i utrwalana w parafinie (FFPE). Dodatkowo trzy pary próbek tkanki tłuszczowej (każda o wymiarach 1x1x1 cm) wraz ze wzrostem odległości od granicy guza będą tworzyły gradient tkanki tłuszczowej od frontu inwazyjnego obszaru guza. Zebrane gradienty są również natychmiast zamrażane w ciekłym azocie, a połowa każdej pary jest przechowywana jako FFPE. Naukowcy przeprowadzili badanie pilotażowe potwierdzające wystarczającą wydajność RNA z zamrożonych próbek tkanek do sekwencjonowania RNA.

Tkanka jest pobierana w ramach ogólnego biobanku badawczego Prospective Breast Cancer Biobank (PBCB) (REK# 2010/1957), trwającego projektu biobanku.

Retrospektywna kohorta Stavanger składała się z wszystkich pacjentek z rakiem piersi, u których rozpoznano inwazyjnego raka piersi pierwszego wystąpienia na oddziale patologii Szpitala Uniwersyteckiego w Stavanger w latach 1993-2004. Ponieważ SUH jest jedynym szpitalem w regionie, jest to prawdziwy biobank populacyjny, zawierający już dane kliniczno-patologiczne, takie jak: klasyfikacja, stopień zaawansowania, TNM, leczenie i markery proliferacji (Ki-67, PPH3/MAI); ostatnia obserwacja kliniczna miała miejsce w 2016 roku.

Naukowcy mają cztery główne hipotezy związane ze stanem zapalnym i naciekiem komórek odpornościowych w raku piersi:

1. Tkanka tłuszczowa przy guzie blisko granicy guza wykazuje zwiększony poziom stanu zapalnego i naciekania komórek odpornościowych.
2. Zapalenie i naciek komórek odpornościowych zmniejszają się wraz ze wzrostem odległości od granicy guza.
3. Istnieją różnice w zapaleniu i naciekaniu komórek odpornościowych między różnymi podtypami raka piersi (luminalny A, luminalny B i podstawnopodobny).
4. Zwiększony stan zapalny i naciek komórek odpornościowych są skorelowane z niekorzystnym wynikiem klinicznym (tj. nawrót choroby).

4.1 PROJEKT BADANIA, METODY I ANALIZY

Naukowcy mają cztery główne hipotezy związane ze stanem zapalnym i naciekiem komórek odpornościowych w raku piersi:

1. Tkanka tłuszczowa przy guzie blisko granicy guza wykazuje zwiększony poziom stanu zapalnego i naciekania komórek odpornościowych.
2. Zapalenie i naciek komórek odpornościowych zmniejszają się wraz ze wzrostem odległości od granicy guza.
3. Istnieją różnice w zapaleniu i naciekaniu komórek odpornościowych między różnymi podtypami raka piersi (luminalny A, luminalny B i podstawnopodobny).
4. Zwiększony stan zapalny i naciek komórek odpornościowych są skorelowane z niekorzystnym wynikiem klinicznym (tj. nawrót choroby).

WP 1: MORFOLOGICZNE I GENOMOWE MAPOWANIE NACIEKU KOMÓREK IMMUNOLOGICZNYCH W TKANCE TŁUSZCZOWEJ OKOLICY RAKA PIERSI

Tło: Zapalenie jest ważnym czynnikiem ułatwiającym rozwój guza (16). Wykazano, że tkanka tłuszczowa w pobliżu raka piersi ma zwiększony naciek komórek odpornościowych, ale nie wiadomo jeszcze, w jaki sposób odnosi się to do podtypów molekularnych i / lub bliskości guza. Naukowcy wykorzystają sekwencjonowanie IHC i RNA do oceny poziomu stanu zapalnego, nacieku komórek odpornościowych i sygnatur ekspresji genów odpornościowych w tkance tłuszczowej otaczającej raka piersi.

Projekt: Prospektywne badanie eksploracyjne Pacjenci, obliczenie materiału i mocy: Tkanka tłuszczowa jest pobierana z prospektywnie pobranych próbek po mastektomii. Próbki tkanek pobiera się z trzech różnych podgrup molekularnych (rak piersi luminalny A, luminalny B i rak podstawny podobny do piersi), po 10 w każdej grupie. Biopsje gruboigłowe pobiera się w gradiencie wraz ze wzrostem odległości od granicy guza (ryc. 1). Norweskie Konsorcjum Genomiczne (NGC) potwierdziło, że rozmiary próbek oparte na selekcji w określonych podtypach raka piersi są wystarczające do uzyskania mocy statystycznej.

Metody: Wycinki tkanki utrwalonej formaliną z guza, tkanki przedniej inwazyjnej i tkanki tłuszczowej (ryc. 1) zostaną wybarwione przy użyciu IHC i przeciwciał przeciwko komórkom odpornościowym (komórki odporności całkowitej, CD45; limfocyty T, CD3, CD8, FoxP3; komórki mieloidalne, CD68 , HLA-DR). Szkiełka zostaną ocenione pod mikroskopem, a wyniki zostaną skorelowane z podgrupami molekularnymi raka piersi, lokalizacją w stosunku do nowotworu i markerami proliferacji (tj. Ki67, PPH3 i MAI). Równolegle naukowcy przeprowadzą sekwencjonowanie RNA na zamrożonej tkance pobranej z tych samych próbek tkanek, jak opisano powyżej. Na danych RNAseq zostanie zastosowanych kilka podejść analitycznych. Z wyjątkiem eksploracyjnej analizy danych, specyficznych algorytmów analizy, w tym dekonwolucji komórek odpornościowych (ABIS, CIBERSORTx), a dokładniej przyglądania się między innymi sygnaturze odpornościowej guza (analiza TIP).

Oczekiwany wynik: Naukowcy spodziewają się wykrycia zwiększonego stanu zapalnego i nacieku komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej przy guzie oraz zmienionej ekspresji sygnatur genów zapalnych, które naukowcy mogą dalej badać w WP 2.

WP 2: OCENA REAKCJI ZAPALNEJ W TKANCE TŁUSZCZOWEJ OKOLICZNOGAZOWEJ W RAKU PIERSI Z WYKORZYSTANIEM IMMUNOHISTOCHEMII I OBRAZOWANIA CYTOMETRII MASOWEJ.

Wstęp: Komórki raka piersi wchodzą w interakcję z otaczającą tkanką i powodują stan zapalny oraz naciek komórek odpornościowych w guzie i tkance tłuszczowej. Obrazowa cytometria mas wykazała, że ​​naciek komórek odpornościowych w guzach koreluje z rokowaniem, ale jak dotąd nie ma badań oceniających, czy tkanka tłuszczowa otaczająca guz również wykazuje strukturalne wzorce nacieku komórek odpornościowych. Dlatego naukowcy zbadają tkankę tłuszczową otaczającą guzy raka piersi za pomocą obrazowej cytometrii masowej Hyperion™.

Projekt: Prospektywne badanie eksploracyjne Pacjenci, obliczenie materiału i mocy: Próbki tkanek pobiera się z 30 prospektywnie pobranych próbek po mastektomii z trzech różnych podgrup molekularnych (rak piersi luminalny A, luminalny B i rak podstawny), po 10 w każdej grupie. Tkankę tłuszczową pobiera się w gradiencie od guza i przeciwległego kwadrantu jako próbkę kontrolną (ryc. 2). Uważa się, że próba licząca 30 pacjentów jest wystarczająca do przeprowadzenia tego rodzaju badania eksploracyjnego.

Metody: Panel Hyperion™ IMC zawierający do 50 unikalnych przeciwciał zostanie opracowany na podstawie już istniejącego i zatwierdzonego panelu dostępnego w głównej placówce UoB, który naukowcy z powodzeniem wykorzystali wcześniej w innych projektach. Dostępny panel zostanie dalej rozszerzony w oparciu o ustalenia z WP 1 i najpierw zweryfikowany na „nieistotnych” próbkach tkanki piersi, zanim zostanie użyty na wyżej opisanych próbkach badawczych. Za pomocą Hyperion™ IMC naukowcy zamierzają przeanalizować poziom odczynu zapalnego w tkance tłuszczowej przy guzie. Dane IMC będą analizowane za pomocą histoCAT+, MAV i FlowJo (zwykle używanych do analizy danych z cytometrii przepływowej, ale również bardzo odpowiednich do analizy obrazowej o wysokich parametrach). Co więcej, badacze będą w stanie wykorzystać dane dotyczące ekspresji genów znanych i nowych czynników, zidentyfikowanych w WP 1, i zwizualizować, czy ekspresja jest uogólniona czy podzielona na przedziały w tkance tłuszczowej. Normalna tkanka tłuszczowa piersi z przeciwległego kwadrantu zostanie użyta jako kontrola. W celu dokładniejszego zbadania wpływu BC na zapalenie okołoguzowej tkanki tłuszczowej różnych podtypów molekularnych, naukowcy zamierzają również wybarwić tkankę z trzech segmentów tkanki rozciągających się od guza, aby określić, czy poziomy zależą od odległość od guza lub podtypu molekularnego (ryc. 1). Stan zapalny w tkance tłuszczowej przy guzie zostanie również oceniony morfologicznie za pomocą IHC. Umożliwi nam to wybranie interesujących regionów do zbadania za pomocą IMC.

Oczekiwany wynik: Naukowcy spodziewają się wykrycia zwiększonego stanu zapalnego i nacieku komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej w pobliżu guza oraz identyfikacji nowych biomarkerów w tkance tłuszczowej, co pozwoli na zbadanie znaczenia klinicznego WP 3.

WP 3: REAKCJA ZAPALNA W TKANCE TŁUSZCZOWEJ OKOLICZNOGAZOWEJ W RAKU PIERSI A WYNIKI KLINICZNE.

Tło:

Immunohistochemia jest kamieniem węgielnym w diagnostyce raka piersi i służy jako główna metoda identyfikacji podgrup molekularnych raka piersi i markerów proliferacji, takich jak Ki-67. Jest to niezbędne do ustalenia, jaki schemat leczenia jest najlepszy dla konkretnego pacjenta. Heterogeniczność tkanki guza (zarówno komórek nowotworowych, jak i naciekających komórek odpornościowych) została powiązana z różnicami w wynikach klinicznych, ale nie wiadomo jeszcze, czy to samo dotyczy tkanki tłuszczowej otaczającej guz. W związku z tym naukowcy zbadają tkankę tłuszczową przy guzie pod kątem stanu zapalnego i nacieku komórek odpornościowych i skorelują to z wynikami klinicznymi u pacjentów z rakiem piersi.

Projekt: Kliniczne badanie obserwacyjne

Pacjenci i metody: Liczba 3500 pacjentek z rakiem piersi zgromadzona jest w biobanku z medianą czasu obserwacji wynoszącą 15 lat. Duży wybór próbek tkanek od tych pacjentów zostanie oceniony pod kątem komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej i biomarkerów odkrytych w WP 1 i 2 za pomocą IHC. Próbki zostaną podzielone na trzy grupy według podgrup molekularnych (tj. Luminal A, Luminal B i Basal jak rak piersi). Preparaty tkankowe zostaną przeanalizowane, a wyniki skorelowane z wynikami klinicznymi z dzienników pacjentów (dostęp do dzienników jest już zatwierdzony przez REK). Wykorzystując proporcjonalny współczynnik ryzyka Coxa i test log-rank, naukowcy ocenią wpływ zwiększonego stanu zapalnego w tkance tłuszczowej na przeżywalność pacjentów.

Obliczenie mocy: Badacze oszacowali moc testową różnicy w przeżyciu bez nawrotu choroby między pacjentami z pozytywnym i negatywnym wynikiem zapalenia w sąsiedztwie guza, zgodnie z oceną IHC i IMC. Miarą efektu jest współczynnik hazardu (HR) obliczony metodą regresji Coxa. Na przykład: 1000 pacjentów z częstością nawrotów 15% stworzy co najmniej 150 punktów końcowych. Jeśli wskaźnik stanu zapalnego wynosi 20%, naukowcy będą mieli 80% mocy do wykrycia różnicy przeżycia przy współczynniku ryzyka (HR) 1,80 lub wyższym.

Oczekiwany wynik: Ten ostatni pakiet prac ma na celu udowodnienie zasady, że możliwe jest włączenie badania histologicznego tkanki tłuszczowej w okolicy guza do diagnostyki raka piersi. W dłuższej perspektywie badania mają na celu identyfikację nowych specyficznych biomarkerów nacieku immunologicznego w tkance tłuszczowej, które korelują z niekorzystnym rokowaniem u chorych na raka piersi. Takie biomarkery mogą służyć jako narzędzia prognostyczne do identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do uzupełniającego leczenia przeciwzapalnego lub immunomodulującego.

-------------------------------------------------- -----------------------------------------------

D.Monitoruj skutki uboczne, QoL, depresję, zmęczenie i udział w życiu zawodowym Tło

Leczenie raka piersi obejmuje wszystkie operacje, chemioterapię, radioterapię i różne opcje terapii celowanej, takie jak terapia antyestrogenowa i anty-HER-2. Te opcje leczenia powodują uciążliwe skutki uboczne zarówno w perspektywie krótko-, jak i długoterminowej. Co ważne, ostatnio odkryto bardziej złożone zależności między metodami terapii onkologicznej a subiektywnymi dolegliwościami zdrowotnymi u pacjentek z rakiem piersi. Wyniki zmęczenia, lęku i depresji są prawdopodobnie funkcjonalnymi odczytami całkowitego obciążenia związanego z leczeniem. Leczenie przeciwnowotworowe ma również istotny wpływ na jakość życia i aspekty społeczne osób, które pokonały chorobę nowotworową, co obejmuje również uczestnictwo w życiu zawodowym. Zwolnienie chorobowe (SL) pięć lat po rozpoznaniu raka piersi jest bardziej zależne od czynników społecznych niż od choroby (2). Dlatego rak piersi dotyka kobiety dwukrotnie; najpierw obciążenie chorobami, a następnie problemy socjoekonomiczne. W badaniu retrospektywnym opartym na rejestrze osoby, które przeżyły raka piersi, mają prawie 3 razy większe ryzyko otrzymania renty inwalidzkiej (DP) w porównaniu z pacjentkami bez raka piersi (3). Jednak badanie to opierało się głównie na porzuconych schematach leczenia onkologicznego.

Celuje

Celem tego badania jest identyfikacja czynników ryzyka stania się długoterminowym odbiornikiem SL, WAA lub DP poprzez dogłębną analizę jakościową i podejście metodą mieszaną poprzez triangulację danych PROM, danych klinicznych/biologicznych i danych NAV. Wykorzystanie danych NAV jako punktów końcowych dostarczy cennych informacji klinicystom i lekarzom ogólnym, którzy mogą zoptymalizować obserwację również w odniesieniu do uczestnictwa w życiu zawodowym. W związku z tym badacze mają solidny projekt badania, aby zidentyfikować czynniki fisk dla wysokich wskaźników SL, WAA i DP. Ostatecznie badacze dążą do obniżenia wydatków finansowych, jakie rak piersi generuje dla społeczeństwa.

Projekt badania / materiał i metody.

Projekt badania jest badaniem obserwacyjnym, w którym badacze w niniejszym badaniu zmapują wskaźniki i czynniki fisk zębowe dla wysokich SL, WAA i DP wśród osób, które przeżyły raka piersi, z aktualnymi harmonogramami leczenia. Badacze zastosują 4-etapowe podejście translacyjne:

1. Badacze najpierw przeprowadzą eksploracyjne badanie jakościowe z wykorzystaniem analizy dokumentów polityki dotyczącej zdrowia i życia zawodowego w kontekście norweskim, w połączeniu z danymi empirycznymi z częściowo ustrukturyzowanych wywiadów i grup fokusowych z 20 pacjentami wysokiego ryzyka, które zostaną przeanalizowane tematycznie. Teoretyczne ramy tego jakościowego projektu wywodzą się z symbolicznego interakcjonizmu, którego celem jest odkrywanie i rozumienie znaczenia w określonych kontekstach. Ponieważ znaczące interakcje społeczne i zawodowe są ważne dla rehabilitacji psychospołecznej osób z rakiem piersi, interakcjonizm symboliczny jest odpowiednią ramą metodologiczną. To podejście jakościowe stworzy podstawy podejścia w poniższych badaniach opartych na PROM i bazach danych NAV.

2. Dane NAV

   Badacze współpracują obecnie z wicedyrektorem Anneline Christine Teigen i starszym konsultantem Günterem Olsborgiem w NAV-Rogaland oraz w sekcji Mikrodata w Statistics Norway (SSB). Celem tej współpracy jest zdobycie większej wiedzy na temat korzystania z usług zabezpieczenia społecznego wśród pacjentów z rakiem piersi wraz z ekspertami NAV-Rogaland oraz wraz z SSB wykorzystanie bazy danych FD-trygd w celu uzyskania wiarygodnych prospektywnych danych socjodemograficznych dotyczących SL (zarówno krótkich, jak i długich okres), zasiłek na ocenę pracy (WAA) (Arbeidsavklaringspenger) i DPs (oba ograniczone czasowo

   i przez całe życie) dla każdego pacjenta w obecnym badaniu PerMoBreCan.

3. Dane dotyczące pomiaru wyników zgłaszanych przez pacjentów (PROM) są uzyskiwane na początku badania, a następnie co roku od wszystkich pacjentów stosujących PerMoBreCan. Dane PROM składają się z 1. narzędzi HRQoL (EORTC QLQ-C30, EORTC QLQ-BR23 i FACT B), 2. szpitalnej skali lęku i depresji, HAD, 3. instrumentów zmęczenia, skali wpływu zmęczenia, FIS; Skala ciężkości zmęczenia (FSS) i zmęczenie VAS, 4. Kwestionariusz skutków ubocznych, 5. Kwestionariusz bólu stawów, 6. Skala niepewności Mishela w chorobie, MUIS; oraz 7. Kwestionariusz nawyków żywieniowych i 8.ROMA III kwestionariusz dolegliwości jelitowych (IBD i IBS).
4. Identyfikacja biomarkerów.

Wszyscy pacjenci biorący udział w tym badaniu zostaną poddani badaniu przesiewowemu pod kątem krążących biomarkerów związanych ze zmęczeniem. Te biomarkery znajdują się na poziomie białka, poziomie ekspresji genetycznej, a także na poziomie epigenetycznym. Nasza wieloletnia przyjemna współpraca z prof. Roald Omdal ze Szpitala Uniwersyteckiego w Stavanger, który jest immunologiem klinicznym i badaczem zmęczenia transalcyjnego, jest zaangażowany w przeprowadzanie tych analiz w swoim laboratorium badawczym.