Biobanking voor toekomstige borstkanker (PBCB)

A. Vroegtijdige opsporing van systemische recidieven bij borstkanker.

WP 1. Analyse van primaire tumor.

Analyse van primaire tumor en metastasen (groep Pathologie). In dit werkpakket wordt zowel DNA als RNA van de primaire tumoren van 125 hoog-risico (Luminal-B) patiënten geanalyseerd door middel van next-generation sequencing (NGS). Bovendien zullen de onderzoekers ook DNA en RNA analyseren van de beschikbare metastatische laesies (momenteel materiaal beschikbaar voor 3/8) die zijn verschenen en zullen verschijnen tijdens de onderzoeksperiode.

MiRNA en mRNA zullen worden geprofileerd met behulp van PureLink™ miRNA Isolation Kit (Invitrogen), Dynabeads mRNA direct micro kit (Ambion) en Ion total RNA-seq kit V2 (Life Technologies) op ons Ion Proton NGS-instrument. Bio-informatica-analyses van gepaarde mRNA- en microRNA-expressieprofielen zullen worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte microRNA's tussen patiënten met en zonder recidieven in behandeling te onthullen. Deze gegevens zullen worden gekoppeld aan onze eerdere studies en worden gebruikt om doelkandidaten voor microRNA-analyse in exosomen en TEP's te identificeren.

Daarnaast zal NGS ook worden uitgevoerd op DNA van de primaire tumoren en metastasen om DNA-mutaties te verifiëren, vooral in ER en andere bekende oncogenen, waaronder die onderzocht in WP3. De DNA-sequencing zal worden uitgevoerd met behulp van de Oncomine Comprehensive Assay. Dit is een op amplicon gebaseerde benadering die hotspot-SNV's, indels en CNV's analyseert. Deze analyses zullen ons biologisch inzicht en achtergrondkennis geven voor elke individuele tumor, en deze datasets kunnen ook worden vergeleken met de recent gepubliceerde gegevens.

WP 2. Circulerende tumorcellen (CTC).

Circulerende tumorcellen (groep Oncologie) Circulerende tumorcellen worden verrijkt uit perifere bloedmonsters door dichtheidscentrifugatie en daaropvolgende immunomagnetische uitputting van leukocyten. De oncologiegroep heeft onlangs een nieuwe uitputtingsmethode ontwikkeld en gepubliceerd, genaamd MINDEC (Multi-marker Immunomagnetische negatieve uitputtingsverrijking van CTC's), die superieure herstel- en verrijkingspercentages heeft. RNA en DNA worden gelijktijdig geïsoleerd uit de verrijkte fractie, om CTC-detectie mogelijk te maken door zowel RNA- als DNA-gebaseerde benaderingen. Specifieke mRNA-markers, met hoge niveaus in tumorcellen en lage niveaus in normale leukocyten, worden vooraf geamplificeerd en gekwantificeerd door real-time PCR als surrogaatmarkers voor CTC's. Zowel epitheelspecifieke markers als markers gerelateerd aan epitheliale mesenchymale overgang maken deel uit van het markerpaneel. Tot nu toe hebben de onderzoekers 170 opeenvolgende bloedmonsters geanalyseerd van het grotere PBCB-cohort, verrijkt met de MINDEC-procedure en bewijs gevonden voor CTC's in ongeveer 20% van de monsters (van zowel laag- als hoogrisicopatiënten), een bevinding die ons aanmoedigt om dit project voort te zetten. De onderzoekers hebben ter vergelijking ook bloedmonsters van 30 gezonde vrouwelijke vrijwilligers geanalyseerd. Alle verzamelde bloedmonsters van 125 hoogrisicopatiënten zullen worden geanalyseerd (ongeveer 575 monsters). De aanwezigheid of het niveau van CTC's in de geanalyseerde monsters zal later worden vergeleken met bekende prognostische factoren, behandelingseffect en ziekte-uitkomst.

WP 3. circulerend tumor-DNA (ctDNA).

Tumorspecifieke mutaties kunnen worden gebruikt als markers voor ctDNA omdat ze niet aanwezig zijn in normale cellen en normaal plasma-DNA. De oncologiegroep heeft onlangs de klinische relevantie van ctDNA-metingen bij alvleesklierkanker aangetoond. De onderzoekers zullen nu ctDNA-niveaus meten in plasmamonsters van borstkankerpatiënten met een hoog risico door gerichte sequencing van de volgende generatie. De onlangs uitgebrachte "Oncomine breast cfDNA assay" (Thermo Fisher) zal worden gebruikt om mutaties op te sporen in een panel van tien genen die vaak gemuteerd zijn bij borstkanker. De assay is gebaseerd op moleculaire barcodes van templates en maakt reproduceerbare detectie van mutaties tot 0,1% controlemonsters mogelijk. Rekening houdend met de lage concentratie celvrij DNA (=cfDNA) in plasma (meestal 10 ng per ml bloed) wordt een gevoeligheid van 0,1% voldoende geacht. De sequencing wordt uitgevoerd op ons Ion Proton NGS-instrument (Life Technologies). In dit WP worden de preoperatieve bloedmonsters en jaarlijkse follow-upmonsters van de 125 hoogrisicopatiënten geanalyseerd. Bloedmonsters van 30 gezonde vrouwelijke vrijwilligers zijn al verzameld en zullen ter vergelijking worden geanalyseerd.

De aanwezigheid en het niveau van tumorspecifieke mutaties zal worden geanalyseerd in relatie tot het behandelingseffect en de uitkomst van de ziekte. Het mutatieprofiel in de primaire tumorbiopsie en de plasmamonsters zullen worden vergeleken om mogelijke heterogeniteit aan het licht te brengen. Bovendien zullen longitudinale veranderingen in het mutatieprofiel van ctDNA worden vergeleken met de ontwikkeling van de ziekte om mogelijk enig licht te werpen op de biologische mechanismen die resistentie tegen behandeling of late terugval van de ziekte veroorzaken.

WP 4. microRNA (miRNA)

Circulerend microRNA uit exosomen en TEP's (Pathologiegroep) Totaal RNA wordt geïsoleerd uit exosomen en TEP's uit de bloedmonsters die voor en tijdens de behandeling zijn afgenomen. De onderzoekers hebben onlangs methoden ontwikkeld voor de isolatie van totaal RNA uit exosomen (met behulp van exoRNeasy serum Plasma kit (Qiagen) en miRCURY RNA isolation kit (Exiqon)) en TEP's. Met behulp van het genoemde protocol is al het totale RNA van exosomen geïsoleerd van alle 125 hoogrisicopatiënten die het eerste bezoek/vóór de behandeling hebben ondergaan, bovendien zal uit de laatste bloedmonsters die van deze patiënten zijn verzameld, totaal RNA worden geïsoleerd van zowel exosomen als TEP's. Bovendien zal een microRNA-profiel worden uitgevoerd op het geïsoleerde RNA met behulp van de pijplijn en het platform dat al is opgezet voor ons Ion Proton-instrument. Deze profielen zullen worden vergeleken met de bio-informatica-analyse van mRNA-miRNA-profielen van de primaire tumor (WP1) en de stalen genomen voor de behandeling. MicroRNA's die vóór de behandeling niet in het weefselmonster en/of in het bloedmonster aanwezig zijn, maar wel in het bloed verschijnen vlak voordat een recidief optreedt, kunnen dan achteraf worden opgespoord in eerdere bloedmonsters om te zien hoe gevoelig deze microRNA's zijn bij het voorspellen van de behandeling weerstand. Het microRNA-profiel van TEP's zal worden vergeleken met het microRNA-profiel van exosomen en met de mRNA-miRNA-profielen van de primaire tumor (WP1), om te zien of TEP's de tumor weerspiegelen en of ze het potentieel hebben om terugval te voorspellen.

WP 5. Metabolomica

Metabolomics is de studie van kleine moleculen die bestaan ​​uit substraten, tussenproducten en eindproducten van het cellulaire metabolisme, zoals aminozuren, suikers en kleine organische zuren. De metabole toestand van kankercellen is aanzienlijk veranderd in vergelijking met normale cellen, een feit dat kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden. Specifieke metabole kenmerken van tumorweefsel bieden aanvullende informatie voor het bepalen van subtypes van borstkanker en het voorspellen van de uitkomst1. Verhoogde tumorlactaat- en glycinespiegels zijn bijvoorbeeld gerelateerd aan een slechte prognose bij patiënten met oestrogeenreceptor (ER) positieve kanker. Metabolomische analyses van primaire tumoren hebben ook voorspellende waarde aangetoond met betrekking tot neoadjuvante behandeling van patiënten met lokaal gevorderde ziekte.

Er is ook aangetoond dat circulerende metabolieten prognostische informatie verschaffen bij operabele borstkanker en het risico verder stratificeren binnen bestaande genetisch bepaalde risicocategorieën. Belangrijk is dat metabolomische veranderingen direct of indirect kunnen voortvloeien uit micrometastatische ziekte, in plaats van primaire tumor. Onlangs hebben de onderzoekers aangetoond dat systemische lactaat- en pyruvaatspiegels een slechtere uitkomst voorspellen bij patiënten met operabele ER-positieve borstkankers. Tumor-aangrenzend weefsel en immunologische reacties kunnen ook bijdragen aan een veranderd metabolomisch profiel. Er zijn ook aanwijzingen dat metabole profilering kan worden gebruikt voor het monitoren van patiënten bij sommige vormen van kanker, hoewel zulk bewijs nog ontbreekt bij borstkanker. Daarom willen de onderzoekers onderzoeken of postoperatieve monitoring door middel van metabole profilering in bloed nuttig is voor het vroegtijdig opsporen van borstkankerrecidief.

WP 6. Integratieve moleculaire monitoring voor recidiefdetectie

Nieuwe technologie heeft een revolutie teweeggebracht in het niveau van biologische informatie die kan worden verkregen uit klinische monsters, vertegenwoordigd door de nieuwe "omics"-termen genomics, transcriptomics, metabolomics, enz. De beschikbaarheid van dergelijke grote datasets, zelfs in het publieke domein, heeft de ontwikkeling van integratieve methoden aangemoedigd die vitale informatie uit meerdere gecombineerde gegevensbronnen kunnen halen. Verrassende nieuwe verbindingen tussen omics-datasets zijn onthuld door dergelijke benaderingen, geïllustreerd door een verband tussen celvrije DNA-fragmentatie en genexpressie46. Dienovereenkomstig is onze kennis over borstkanker ook uitgebreid door integratieve benaderingen, wat heeft geleid tot een beter begrip van de ziekte. Zo is de prognostische subclassificatie van borstkanker verfijnd en zijn nieuwe tumorspecifieke antigenen geïdentificeerd. Er is zelfs aangetoond dat geïntegreerde moleculaire gegevens een hogere prognostische kracht hebben dan afzonderlijke moleculaire niveaus bij borstkanker. Daarom is een gecombineerde analyse van de genetische (ctDNA), transcriptomische (miRNA) en metabolomische gegevensniveaus in perifere bloedmonsters gepland in het huidige project om hun gezamenlijke biomarkerpotentieel bij operabele borstkanker te maximaliseren.

Berekeningen van de steekproefomvang.

De onderzoekers voerden berekeningen van de steekproefomvang uit met behulp van SPSS Sample Power-software. Deze berekeningen toonden aan dat 125 hoogrisicopatiënten voldoende zouden moeten zijn om een ​​log-rank testvermogen van 80% te geven bij het testen van de prognostische waarde van ctDNA/CTC-detectie vóór de operatie. De berekeningen van de steekproefomvang waren gebaseerd op de gekwalificeerde aanname dat het gemiddelde overlevingspercentage na 5 jaar in de hoogrisicogroep 90% is, terwijl dit respectievelijk 75% en 95% is in de ctDNA/CTC-positieve en -negatieve subgroepen. Van de naar schatting 125 patiënten werden er 30 verondersteld positief te zijn voor ctDNA/CTC en 95 negatief.

-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----

B. Verbeter de medicijnbewaking van tamoxifen bij borstkanker

Ongeveer 75% van alle borstkanker behoort tot de luminale subtypes, die de hormonale receptoren oestrogeenreceptor en progesteronreceptor tot expressie brengen. Deze patiënten worden behandeld met de anti-oestrogene medicijnen; tamoxifen en/of aromataseremmers. De twee meest actieve metabolieten van tamoxifen zijn Z-4OHtam en Z-4OHNDtam (Z-endoxifen) hebben een 30-100 keer hogere affiniteit voor ER dan tamoxifen. Deze metabolieten vormen uiteindelijk het blokkerende effect op het ER-niveau met als doel micro-metastatische ziekte uit te roeien en zijn verantwoordelijk voor de verbeterde overleving na het instellen van deze adjuvante systemische behandeling. Directe meting van deze metabolieten omzeilt alle verstoringen van de diversiteit van CYP2D6-activiteit, d.w.z. alternatieve metabole routes, therapietrouw en remming van geneesmiddelinteracties. Onze nieuwe LC/MS-MS-methodologie houdt rekening met alle bovengenoemde variabelen en levert een functioneel uitleesrapport van de serumspiegel van de actieve tamoxifen-metabolieten bij de individuele patiënt. Deze methode kan ook onderscheid maken tussen de inactieve en actieve isomeren van endoxifen en 4-OHtam, de meest actieve ER-blokkerende metabolieten van tamoxifen. In samenwerking met de Oslo Breast Cancer Research Group hebben de onderzoekers onlangs in een retrospectieve observationele studie aangetoond dat patiënten met lage serumconcentraties van Z-4OHtam < 3,26 nM of Z-Endoxifen < 9,00 nM (ongeveer 12% van alle patiënten) significante slechtere borstkankerspecifieke en totale overleving dan patiënten met serumconcentraties boven deze drempels (gecorrigeerde HR = 4,3; CI95 = 1,9-13,6) (rode curven in figuur 4). Patiënten met een zeer hoog niveau van deze metabolieten (ongeveer 12% van de patiënten) hadden geen borstspecifieke eindpunten. Nu moeten de onderzoekers deze ontdekking valideren in onafhankelijk patiëntenmateriaal. Indien gevalideerd, zal dit van direct klinisch voordeel zijn voor 25% van de ER + borstkankerpatiënten die adjuvante behandeling met tamoxifen plannen. Dergelijke therapeutische geneesmiddelmonitoring (TDM) zou risicopatiënten kunnen identificeren met onvoldoende niveaus van actieve tamoxifen-metabolieten. Dit zou bij deze patiënten kunnen leiden tot een dosisverhoging of overschakeling op een alternatieve endocriene behandelingsvorm. Patiënten met zeer hoge metabolietspiegels kunnen tamoxifen blijven gebruiken en hoeven niet over te stappen op een aromataseremmer.

TDM kan dus een paradigmatische verschuiving blijken te zijn in de endocriene behandeling van ER-positieve borstkanker. Belangrijk is dat de afstand van "bank naar bed" in deze studie erg kort is vanwege onze recente bevindingen, een haalbare methode en meer dan 30 jaar ervaring met tamoxifen in de klinische setting.

-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----

C. Micro-omgeving van tumoren bij borstkanker - stromale immuuninfiltratie van vetweefsel en interactie met tumor in de groeizone

Achtergrond: Borstkanker is nog steeds de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen in de westerse wereld, inclusief Noorwegen. Jaarlijks worden ongeveer 3500 nieuwe Noorse borstkankerpatiënten gediagnosticeerd. In de afgelopen 50 jaar is de incidentie van borstkanker in Noorwegen meer dan verdubbeld. Interessant is dat in dezelfde periode overgewicht en obesitas alarmerend zijn toegenomen. Moleculaire subtypering van borstkankertumoren heeft het begrip van de intrinsieke biologie verbeterd. Dit heeft geleid tot een meer gepersonaliseerde behandelingsbenadering en verbeterde de resultaten voor borstkankerpatiënten in de afgelopen 20 jaar.

Naast de moleculaire subtypering bestaat de diagnostiek van borstkanker tegenwoordig uit stadiëring (via het TNM-classificatiesysteem) en microscopisch onderzoek door een patholoog. Er is steeds meer bewijs voor de prognostische waarde van het evalueren van de micro-omgeving van de tumor (bijv. tumor infiltrerende lymfocyten (TIL's)) als onderdeel van de diagnostiek bij borstkanker, maar wordt in de klinische praktijk nog niet toegepast. Hoge aantallen TIL's zijn sterk geassocieerd met een goede prognose bij patiënten met triple-negatieve borstkanker, maar hebben een dergelijke correlatie niet aangetoond bij luminale borstkanker. Macrofagen in borstvetweefsel differentiëren in twee verschillende fenotypes, vaak geclassificeerd als M1 en M2 met een toename van de laatste bij borstkanker. M1 valt kankercellen aan en fagocyteert ze, terwijl M2 ontstekingsremmende eigenschappen heeft en waarvan is aangetoond dat het tumorbevorderende functies heeft.

Dit project zal onze kennis vergroten over de interactie tussen de primaire borsttumor en de infiltratie van immuuncellen in het juxta-tumorale vetweefsel. Onze bevindingen zullen worden gecorreleerd met moleculaire subtypes van borstkanker, nabijheid van tumor, markers van proliferatie en uiteindelijk met klinische uitkomst. De onderzoekers redeneren dat deze kennis nieuwe voorspellende doelen zal bieden voor immuunmodulerende adjuvante kankertherapie. Dit doctoraatsproject heeft drie onderling gerelateerde werkpakketten (WP) met als uiteindelijk doel het identificeren van ontstekingsmarkers in juxta-tumoraal vetweefsel die relevant zijn bij de klinische beoordeling van adjuvante therapie van borstkanker. In WP 1 en 2 zal het fenotypische en genomische landschap van juxta-tumoraal vetweefsel worden gekarakteriseerd, en in WP 3 zullen de onderzoekers onderzoeken of deze kennis de klinische uitkomst kan voorspellen.

Het project is gebaseerd op een sterke regionale samenwerking tussen het Haukeland University Hospital (HUH) en het Stavanger University Hospital (SUH). Voor het huidige project hebben de onderzoekers op een systematische manier vet- en tumorweefsel verzameld van 30 opeenvolgende borstkankerpatiënten die borstamputaties ondergingen bij SUH. Chirurgische monsters van de borst worden onverwijld doorgestuurd naar de patholoog die, onder morfologische controle, relevant weefsel bemonstert van het invasieve front en de kern (0,5x1x1 cm) van de primaire tumor. Controles van normaal borstweefsel (2000 mg) van het verre contralaterale kwadrant zullen ook worden verzameld en morfologisch geverifieerd door de patholoog. Het weefsel wordt verzameld in dubbele paren. Een van de monsters wordt onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof voor conservering, terwijl de andere helft van elk paar wordt geconserveerd in formaline en gefixeerd in paraffine (FFPE). Bovendien vormen drie paren vetweefselmonsters (elk van 1x1x1 cm) met toenemende afstand van de tumorgrens een gradiënt van vetweefsel vanaf de invasieve voorkant van het tumorgebied. De verzamelde gradiënten worden ook onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en de helft van elk paar wordt opgeslagen als FFPE. De onderzoekers hebben een pilootstudie uitgevoerd die een voldoende RNA-opbrengst van de ingevroren weefselmonsters voor RNA-sequencing bevestigt.

Het weefsel wordt verzameld als onderdeel van de biobank voor algemeen onderzoek, Prospective Breast Cancer Biobank (PBCB) (REK# 2010/1957), een lopend biobankproject.

Het retrospectieve Stavanger-cohort bestaat uit alle borstkankerpatiënten bij wie de diagnose invasieve borstkanker voor het eerst werd gesteld op de afdeling Pathologie van het Stavanger University Hospital, tussen 1993 en 2004. Aangezien SUH het enige ziekenhuis in de regio is, is dit een echte biobank op basis van de populatie, waarin al klinisch-pathologische gegevens zijn opgenomen, zoals: indeling, stadium, TNM, behandelings- en proliferatiemarkers (Ki-67, PPH3/MAI); laatste klinische follow-up vond plaats in 2016.

De onderzoeken hebben vier hoofdhypothesen met betrekking tot ontsteking en infiltratie van immuuncellen bij borstkanker:

1. Het juxta-tumorale vetweefsel dicht bij de tumorgrens vertoont een verhoogde mate van ontsteking en immuuncelinfiltratie.
2. De ontsteking en de infiltratie van immuuncellen verzwakken naarmate de afstand tot de tumorgrens groter wordt.
3. Er zijn verschillen in de ontsteking en infiltratie van immuuncellen tussen verschillende subtypes van borstkanker (luminaal A, luminaal B en basaalachtig).
4. Verhoogde ontsteking en infiltratie van immuuncellen zijn gecorreleerd met een ongunstig klinisch resultaat (d.w.z. terugval van ziekte).

4.1 ONDERZOEKSOPZET, METHODEN EN ANALYSES

De onderzoeken hebben vier hoofdhypothesen met betrekking tot ontsteking en infiltratie van immuuncellen bij borstkanker:

1. Het juxta-tumorale vetweefsel dicht bij de tumorgrens vertoont een verhoogde mate van ontsteking en immuuncelinfiltratie.
2. De ontsteking en de infiltratie van immuuncellen verzwakken naarmate de afstand tot de tumorgrens groter wordt.
3. Er zijn verschillen in de ontsteking en infiltratie van immuuncellen tussen verschillende subtypes van borstkanker (luminaal A, luminaal B en basaalachtig).
4. Verhoogde ontsteking en infiltratie van immuuncellen zijn gecorreleerd met een ongunstig klinisch resultaat (d.w.z. terugval van ziekte).

WP 1: MORFOLOGISCH EN GENOMISCH IN KAART BRENGEN VAN IMMUUNCELINFILTRATIE IN VEDIETWEEFSEL RONDOM BORSTKANKER

Achtergrond: Ontsteking is een belangrijke facilitator voor tumorontwikkeling (16). Er is aangetoond dat vetweefsel in de buurt van borstkanker een verhoogde infiltratie van immuuncellen heeft, maar het is nog niet bekend hoe dit zich verhoudt tot moleculaire subtypes en/of nabijheid tot tumor. De onderzoeken zullen IHC en RNA-sequencing gebruiken om het niveau van ontsteking, infiltratie van immuuncellen en handtekeningen van immuungenexpressie in het vetweefsel rond borstkanker te evalueren.

Opzet: Prospectief verkennend onderzoek Patiënten, materiaal- en krachtberekening: Vetweefsel wordt verzameld van de prospectief verzamelde mastectomiespecimens. Weefselmonsters worden verzameld uit drie verschillende moleculaire subgroepen (luminaal A, luminaal B en basale borstkanker), 10 in elke groep. Kernbiopten worden verzameld in een gradiënt met toenemende afstand van de tumorgrens (fig. 1). Het Norwegian Genomics Consortium (NGC) heeft bevestigd dat de steekproefomvang die is gebaseerd op de selectie in specifieke subtypes van borstkanker voldoende is voor statistische power.

Methoden: Dia's van met formaline gefixeerd weefsel van tumor, invasief front en vetweefsel (fig. 1) worden gekleurd met behulp van IHC en antilichamen tegen immuuncellen (totale immuuncellen, CD45; T-cellen, CD3, CD8, FoxP3; myeloïde cellen, CD68 , HLA-DR). De objectglaasjes zullen worden geëvalueerd door microscopie en de resultaten zullen worden gecorreleerd met moleculaire subgroepen van borstkanker, lokalisatie in relatie tot tumor- en proliferatiemarkers (d.w.z. Ki67, PPH3 en MAI). Tegelijkertijd zullen de onderzoekers RNA-sequencing uitvoeren op bevroren weefsel dat is verzameld uit dezelfde weefselmonsters als hierboven beschreven. Er zullen verschillende analysebenaderingen worden gebruikt op de RNAseq-gegevens. Behalve het analyseren van de gegevens verkennend, specifieke analyse-algoritmen, waaronder deconvolutie van immuuncellen (ABIS, CIBERSORTx) en meer specifiek kijken naar tumor-immuunsignaturen (TIP-analyse), onder andere.

Verwacht resultaat: De onderzoekers verwachten verhoogde ontsteking en infiltratie van immuuncellen in het juxta-tumorale vetweefsel en veranderde expressie van inflammatoire genkenmerken die de onderzoekers verder kunnen onderzoeken in WP 2.

WP 2: BEOORDELING VAN ONTSTEKINGSREACTIE IN JUXTA-TUMOURAAL ADIPOSEWEEFSEL BIJ BORSTKANKER MET BEHULP VAN IMMUNOHISTOCHEMIE EN AFBEELDING VAN MASSACYTOMETRIE.

Achtergrond: Borstkankercellen interageren met het omliggende weefsel en veroorzaken ontstekingen en infiltratie van immuuncellen in de tumor en het vetweefsel. Beeldvorming van massacytometrie heeft aangetoond dat infiltratie van immuuncellen in tumoren correleert met de prognose, maar tot nu toe zijn er geen studies die onderzoeken of het vetweefsel rondom de tumor ook structurele patronen van infiltratie van immuuncellen vertoont. Daarom zullen de onderzoekers het vetweefsel rondom borstkankertumoren onderzoeken met behulp van Hyperion™ Imaging Mass Cytometry.

Opzet: Prospectief verkennend onderzoek Patiënten, materiaal- en vermogensberekening: Weefselmonsters worden verzameld van 30 prospectief verkregen borstamputatiespecimens met drie verschillende moleculaire subgroepen (luminaal A, luminaal B en basaalachtige borstkanker), 10 in elke groep. Vetweefsel wordt verzameld in een gradiënt weg van de tumor en van het contralaterale kwadrant als controlemonster (fig. 2). Voor een dergelijk verkennend onderzoek wordt een steekproefomvang van 30 patiënten voldoende geacht.

Methoden: Er zal een Hyperion™ IMC-panel van maximaal 50 unieke antilichamen worden ontwikkeld op basis van een reeds bestaand en gevalideerd panel dat beschikbaar is in de UoB-kernfaciliteit en dat de onderzoekers eerder met succes in andere projecten hebben gebruikt. Het beschikbare panel zal verder worden uitgebreid op basis van bevindingen uit WP 1 en eerst worden gevalideerd op "niet-essentiële" borstweefselmonsters alvorens te worden gebruikt op de hierboven beschreven onderzoeksmonsters. Met behulp van Hyperion™ IMC willen de onderzoekers de niveaus van ontstekingsreacties in het juxta-tumorale vetweefsel analyseren. IMC-gegevens zullen worden geanalyseerd met histoCAT+, MAV en FlowJo (meestal gebruikt voor data-analyse met flowcytometrie, maar ook zeer geschikt voor high-parameter beeldvormingsanalyse). Bovendien zullen de onderzoekers genexpressiegegevens kunnen gebruiken van bekende en nieuwe factoren, geïdentificeerd in WP 1, en kunnen visualiseren of de expressie gegeneraliseerd of gecompartimenteerd is in het vetweefsel. Normaal borstvetweefsel uit het contralaterale kwadrant zal als controle worden gebruikt. Om de invloed van BC op de ontsteking van juxta-tumoraal vetweefsel van de verschillende moleculaire subtypes in meer detail te onderzoeken, willen de onderzoekers ook weefsel kleuren van drie weefselsegmenten die uit de tumor steken om te bepalen of de niveaus afhankelijk zijn van de afstand tot de tumor of het moleculaire subtype (fig. 1). De ontsteking in het juxta-tumorale vetweefsel zal ook morfologisch worden beoordeeld met behulp van IHC. Dit stelt ons in staat om interessante regio's te selecteren om te onderzoeken met behulp van IMC.

Verwacht resultaat: De onderzoekers verwachten verhoogde ontsteking en infiltratie van immuuncellen in het vetweefsel nabij de tumor te vinden en nieuwe biomarkers in het vetweefsel te identificeren, waardoor de klinische betekenis in WP 3 kan worden onderzocht.

WP 3: ONTSTEKINGSREACTIE IN JUXTA-TUMORAAL ADIPOSEWEEFSEL BIJ BORSTKANKER EN KLINISCHE UITKOMST.

Achtergrond:

Immunohistochemie is een hoeksteen in de diagnostiek van borstkanker en dient als de belangrijkste modaliteit voor het identificeren van moleculaire subgroepen van borstkanker en proliferatiemarkers zoals Ki-67. Dit is essentieel om te bepalen welk behandelingsregime het meest geschikt is voor de specifieke patiënt. Heterogeniteit in het tumorweefsel (zowel tumorcellen als infiltrerende immuuncellen) is in verband gebracht met verschil in klinische uitkomst, maar het is nog niet bekend of hetzelfde geldt voor het vetweefsel rondom de tumor. De onderzoekers zullen dus juxta-tumoraal vetweefsel onderzoeken op ontsteking en infiltratie van immuuncellen en dit correleren met de klinische uitkomst bij borstkankerpatiënten.

Opzet: Klinisch observationeel onderzoek

Patiënten en methoden: Een aantal van 3500 borstkankerpatiënten wordt opgebouwd in een biobank met een mediane follow-up tijd van 15 jaar. Een grote selectie van weefselmonsters van deze patiënten zal met behulp van IHC worden beoordeeld op immuuncellen in het vetweefsel en biomarkers ontdekt in WP 1 en 2. De monsters worden gestratificeerd in drie groepen volgens moleculaire subgroepen (d.w.z. Luminaal A, Luminaal B en Basaal zoals borstkanker). De weefselglaasjes worden geanalyseerd en de resultaten worden gecorreleerd met de klinische uitkomst van de patiëntenjournalen (toegang tot tijdschriften is al goedgekeurd door REK). Met behulp van Cox proportionele hazard ratio en log-rank test, zullen de onderzoeken het effect evalueren dat verhoogde ontsteking in vetweefsel heeft op de overlevingskansen van de patiënt.

Power-berekening: De onderzoekers schatten het testvermogen van het verschil in recidiefvrije overleving tussen patiënten positief en negatief voor juxta-tumorontsteking zoals beoordeeld door IHC en IMC. De effectmaat is de hazard rate (HR) zoals berekend met de Cox-regressiemethode. Bijvoorbeeld: 1000 patiënten met een recidiefpercentage van 15% zullen minimaal 150 eindpunten hebben gecreëerd. Als het ontstekingspercentage 20% is, hebben de onderzoeken een vermogen van 80% om een ​​overlevingsverschil te detecteren met een hazard ratio (HR) van 1,80 of hoger.

Verwacht resultaat: Dit laatste werkpakket is ontworpen om het principe te bewijzen dat het haalbaar is om histologisch onderzoek van juxta-tumoraal vetweefsel op te nemen als onderdeel van de diagnostiek van borstkanker. Op langere termijn hebben de onderzoeken tot doel nieuwe specifieke biomarkers van immuuninfiltratie in vetweefsel te identificeren die correleren met nadelige uitkomsten bij borstkankerpatiënten. Dergelijke biomarkers kunnen dienen als voorspellende hulpmiddelen voor het identificeren van patiënten die in aanmerking komen voor adjuvante ontstekingsremmende of immuunmodulerende behandeling.

-------------------------------------------------- -----------------------------------------------

D.Monitor bijwerkingen, kwaliteit van leven, depressie, vermoeidheid en arbeidsparticipatie Achtergrond

Behandeling van borstkanker maakt gebruik van alle chirurgie, chemotherapie, bestralingstherapie en verschillende gerichte therapieopties zoals anti-oestrogeen- en anti-HER-2-therapie. Deze behandelingsopties creëren vervelende bijwerkingen, zowel op korte als op lange termijn. Belangrijk is dat recentelijk meer complexe relaties tussen oncologische therapiemodaliteiten en subjectieve gezondheidsklachten bij borstkankerpatiënten zijn ontdekt. Vermoeidheids-, angst- en depressiescores zijn waarschijnlijk functionele uitlezingen van de totale behandellast. De antikankerbehandeling heeft ook een substantiële impact op de levenskwaliteit en sociale aspecten van de overlevenden van kanker, wat zich uitstrekt tot de arbeidsparticipatie. Ziekteverzuim vijf jaar na de diagnose borstkanker is meer afhankelijk van sociale factoren dan van ziekte (2). Vandaar dat borstkanker de vrouwen twee keer treft; eerst de ziektelast dan de sociaal-economische zorgen. Borstkankeroverlevenden hebben bijna 3x meer kans op een arbeidsongeschiktheidspensioen (DP) dan kankervrije patiënten in een retrospectieve, op registers gebaseerde studie (3). Deze studie was echter gebaseerd op grotendeels verlaten oncologische behandelingsregimes.

Doelstellingen

Het doel van deze studie is om risicofactoren te identificeren voor het worden van een SL-, WAA- of DP-ontvanger op lange termijn door een diepgaande kwalitatieve analyse en een gemengde methodebenadering door PROM-gegevens, klinische/biologische gegevens en de NAV-gegevens te trianguleren. Het gebruik van NAV-gegevens als eindpunten zal waardevolle informatie opleveren voor clinici en huisartsen die de follow-up kunnen optimaliseren, ook met betrekking tot werk-privéparticipatie. Daarom hebben de onderzoekers een robuust onderzoeksontwerp om fisk-factoren voor hoge SL-, WAA- en DP-percentages te identificeren. Uiteindelijk streven de onderzoekers naar het verlagen van de financiële kosten die borstkanker voor de samenleving genereert.

Studie opzet / materiaal & methodes.

De onderzoeksopzet is een observationele studie waarbij de onderzoekers in de huidige studie de tarieven van en denty fisk-factoren voor hoge SL, WAA en DP onder overlevenden van borstkanker in kaart zullen brengen met de up-to-date behandelingsschema's. De onderzoekers volgen een translationele aanpak in vier stappen:

1. De onderzoekers zullen eerst een verkennend kwalitatief onderzoek uitvoeren met behulp van documentanalyse van gezondheids- en werklevensbeleid in de Noorse context, gecombineerd met empirische gegevens uit semigestructureerde interviews en focusgroep met 20 hoogrisicopatiënten) om thematisch te analyseren. Het theoretisch kader voor dit kwalitatieve project is afgeleid van symbolisch interactionisme waarin het blootleggen en begrijpen van betekenis in specifieke contexten een doel is. Aangezien zinvolle sociale en professionele interacties belangrijk zijn voor de psychosociale rehabilitatie van individuen met borstkanker, is symbolisch interactionisme een geschikt methodologisch kader. Deze kwalitatieve benadering zal de basis vormen voor de benadering in de PROM-gebaseerde en NAV-database-georiënteerde onderzoeken hieronder.

2. NAV-gegevens

   De onderzoekers werken momenteel samen met vice-directeur Anneline Christine Teigen en senior consultant Günter Olsborg in NAV-Rogaland en de sectie Mikrodata van Statistics Norway (SSB). Het doel van deze samenwerking is om samen met de NAV-Rogaland-experts meer kennis op te doen over het gebruik van sociale zekerheidsdiensten bij borstkankerpatiënten en samen met SSB de FD-trygd-database te gebruiken om betrouwbare prospectieve sociodemografische gegevens over SL's (zowel korte als lange termijn), Work Assessment Allowance (WAA) (Arbeidsavklaringspenger) en DP's (beide

   & levenslang) voor elke patiënt in de huidige PerMoBreCan-studie.

3. Patiëntgerapporteerde uitkomstmaat (PROM)-gegevens worden verkregen bij baseline en daarna jaarlijks van alle PerMoBreCan-patiënten. De PROM-gegevens bestaan ​​uit 1.HRQoL-instrumenten (EORTC QLQ-C30,EORTC QLQ-BR23 en FACT B), 2.Hospital Anxiety and Depression Scale, HAD, 3. Vermoeidheidsinstrumenten Fatique Impact Scale, FIS; Fatugue Severity Scale (FSS) en VAS-vermoeidheid, 4. Vragenlijsten over bijwerkingen, 5. Vragenlijst over gewrichtspijn, 6. De Mishel-onzekerheid in ziekteschaal, MUIS; en 7. Vragenlijst voedingsgewoonten en de 8.ROMA III vragenlijst darmklachten (IBD en PDS).
4. Identificatie van biomarkers.

Alle patiënten die deelnemen aan deze studie zullen worden gescreend op circulerende biomarkers die verband houden met vermoeidheid. Deze biomarkers bevinden zich op eiwitniveau, genetische expressieniveau en ook op epigenetisch niveau. Onze jarenlange prettige samenwerking met prof. Roald Omdal van het Stavanger Universitair Ziekenhuis, klinisch immunoloog en transaltional vermoeidheidsonderzoeker, zet zich in om deze analyses uit te voeren in zijn onderzoekslaboratorium.