Seerumin proteomin karakterisointi potilailla, joilla on Prader Willi -syndrooma (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Menetelmät Tutkimuksen suunnittelu Tutkimus sisältää kaksi vaihetta, ensimmäinen tutkiva vaihe, joka tunnetaan nimellä "löytö", jossa 30 potilasta, joilla on Prader-Willin oireyhtymä (PWS), analysoidaan SOMAscan-tekniikalla seerumin proteomisen profiilin tekemiseksi. Maksan steatoosi määritetään käyttämällä vatsan ultraääntä PWS-potilailla määrittämällä kontrolliryhmä (steatoosi aste 0/1) ja steatoosi (steatoosi aste 2/3). Myöhemmin vähintään kaksi ehdokasbiomarkkeria valitaan ja validoidaan ELISA:lla löytövaiheessa käytetyistä 30 näytteestä (näytteet, joita on jo seerumipankissamme) ja vielä 22 näytettä PWS-potilaista, jotka on otettu erityisesti tähän tutkimukseen.

Potilaat:

Huomioon otetaan 30 tutkittavaa, jotka on jo rekrytoitu edellisessä MIRNOMAPWS-projektissamme (RC-2018), joilla on geneettinen PWS-diagnoosi, molemmista sukupuolista ja iältään 18–45 vuotta lähtötilanteessa.

Jokaiselta potilaalta kerätään seuraavat muuttujat lääketieteellisistä tiedoista:

• antropometriset parametrit (pituus, paino, BMI, vyötärön ympärysmitta);
• kehon koostumus (laiha massa, rasvamassa) käyttäen impedanssin mittaustekniikkaa (BIA);
• steatoositasot mitataan ultraäänellä standardikriteerien mukaisesti
• perusaineenvaihdunta käyttämällä epäsuoraa kalorimetriaa;
• metabolisen oireyhtymän määrittävät biokemialliset parametrit (HDL-kolesteroli, triglyseridit, verensokeri);
• verenpaine;
• samanaikainen hormonihoito (kasvuhormonihoito, sukupuolisteroidit ja/tai l-tyroksiini).

Seerumin kerääminen proteominen analyysi: proteominen analyysi suoritetaan jo saatavilla oleville 30 näytteelle (käytetään "löytövaiheessa") ja 22 uudelle potilaalle. Samoin kuin MIRNOMAPWS-projektille (RC-2018) tehtiin, uusien potilaiden paastoverinäytteet otetaan tavallisella laskimopunktiolla BD Vacutainer® seerumierotusputkiin (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) ja sentrifugoidaan 1900 g 4°:ssa. C 10 minuuttia ja 16 000 g 4 °C:ssa vielä 10 minuuttia. Supernatantit jäädytettiin -80 °C:ssa pitkäaikaista varastointia varten.

Proteominen analyysi: ennen proteomista analyysiä hemoglobiinin läsnäolo arvioidaan spektrofotometrillä Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) käyttäen Harboen suoraa spektrofotometristä menetelmää Allen-korjauksella: Hb (g / L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / laimennus dH2O:ssa. Seerumin raja-arvo on 0,020 g/l.

Seerumin proteomiseen karakterisointiin käytetään uutta korkean suorituskyvyn omics-tekniikkaa, joka perustuu SomaLogic SOMAscan -alustaan. Järjestelmä perustuu SOMAmeerien (Slow Off-rate Modified Aptamers) havaitsemiseen, jotka ovat DNA:n aptameerisiä muotoja, joilla on korkea affiniteetti ja spesifisyys proteiinikohteeseen. Lisäksi nämä aptameerit ovat resistenttejä nukleotidaasiaktiivisuudelle ja niillä on korkeampi affiniteetti kuin normaalit vasta-aineet. Tässä tutkimuksessa käytetyn paneelin avulla voimme arvioida 1500 proteiinikohdetta, jotka osallistuvat aineenvaihduntasairauksien kehittymiseen, ovat osa yleistä tulehdusreaktiota ja ovat kiinnostavia sydän- ja verisuonitautien ja onkologian tutkimuksessa.

Yleisesti ottaen testin herkkyys ja suorituskyky ovat verrattavissa normaaliin ELISA-sarjaan, jossa kvantifiointirajat ovat noin 100 fM ja havaitsemisrajat 40 fM, ja näytettä tarvitaan vain 65 µl.

Ehdokkaiden validointi ELISA:lla: Tässä vaiheessa validoidaan vähintään kaksi merkkiä, jotka tunnistetaan löytövaiheessa ja jotka ovat osoittaneet merkittävän yhteyden rasvakudoksen lisääntymiseen moniparametrisissa korrelaatioanalyyseissä. Validointi suoritetaan kvantifioimalla ehdokkaiden määrä seeruminäytteissä käyttämällä erityisiä sandwich-tyyppisiä kaupallisia ELISA-pakkauksia. Kuten edellisessä osiossa mainittiin, mitataan yhteensä 52 näytettä, joista 30 on ilmoittautunut löytövaiheeseen (seerumit jo tallennettu) ja toiset 22 uutta näytettä validointivaiheeseen ilmoittautuneilta koehenkilöiltä.